腺苷信号传导到星形胶质细胞辅助脑代谢和功能

　　所有动物研究均根据《 2010/63/eu》（欧洲委员会的保护范围，用于实验性和其他科学目的的脊椎动物保护公约）和英国家庭办公室动物（1986年）的《欧洲保护动物公约》（1986年）进行，并在伦敦大学学院的机构动物护理和使用委员会的项目批准下进行。将动物组合到12小时的光周期中，并随意获得水和食物。将小鼠在24°C的环境温度下容纳，相对湿度保持在60±5％。将大鼠在22°C的环境温度和55±10％的相对湿度下容纳。 　　男性和女性野生型和Adora2bflox/Flox小鼠在星形胶质细胞或年轻的Sprague-Dawley大鼠（P21（P21） - P20 –p30）中转换为改进的CRE（ICRE）重组酶或TDTOMATO，并用同甲酸酯术，hippheTheT和Isoflurane，hippains haiphetaal s antinal hasears，hipphe（300–350μm）在包含：64 mm NaCl，2.5 mm Kcl，1.25 mm NAH2PO4、0.5 mm Cacl2、7 mm mgcl2、25 mm NaHCO3、15 mm NaHCO3、10 mm葡萄糖和10 mm葡萄糖和120 mm酸的含量，95％CO2和5％CO2和5％的CO2（5％）中。然后将切片在含有的人造脑脊液（ACSF）中恢复1小时，其中包括：119 mM NaCl，10 mM葡萄糖，3 mM KCl，2 mM MGSO4、1.25 mm NAH2PO4、26毫米NAHCO3和26 mm NAHCO3和2 mm CACL2（pH 7.4; 3.4; 300-300-300-310 MOSM）。 　　如前所述42，从大鼠（性别的p5 – p7）或小鼠（任何性别的P8 – p10）大脑中获得了器官型海马切片制剂。The animals were terminally anaesthetized with isoflurane, and the brains were isolated and placed in ice-cold Hanks’ balanced salt solution (HBSS; Thermo Fisher) without Ca2+, with added 20 mM glu​​cose (total 25.6 mM glu​​cose), 10 mM MgCl2, 1 mM HEPES, 1 mM kynurenic acid, 0.005% phenol red, 100 U ml−1青霉素和0.1 mg ml -1链霉素。切割冠状脑切片（350μm）并将其铺在0.4μm膜插入物（Millicell CM，Millipore）上。将切片在含有50％Opti-MEM-1（Thermo Fisher），25％FBS（Sigma-Aldrich），21.5％HBSS，25 mM葡萄糖，100 U ML-1 Penicillin和0.1 mg Mg ML-1链霉素的培养基中孵育。3天后，将孵育培养基替换为新鲜培养基，然后每周两次更换。在GFAP启动子的控制下，星形胶质细胞被转导，以表达遗传编码的荧光cAMP传感器EPAC-SH187（参考文献14）或PKA活性传感器AKAR4（参考文献15）。腺病毒矢量AVV-GFAP-EPAC-SH187（1.0×1010 PFU ML-1）或AVV-GFAP-AKAR4（1.0×1010 PFU ML-1）在孵育后9-14天后孵育培养基，在孵育9-14天后，在经过3-5天后，在实验中使用了SLICES。 　　如前所述44，由大鼠和小鼠幼崽（两性的p2 – P3）的大脑制备原发性星形胶质细胞培养物。这些动物被异氟烷末端麻醉，并去除大脑，并通过解剖分离感兴趣的大脑区域。分离后，将细胞铺在聚菌素涂层的盖玻片上，并在DMEM培养基（Thermo Fisher）中保持10％FBS，青霉素（100 U ML-1）和链霉素（0.1 mg ML-1）在37°C下在5％CO2和95％空气中的37°C下进行，以便在5％CO2和95％空气中进行实验。 　　在新生儿小鼠（两性的P0 – P2）中，在荧光脑中荧光传感器的广泛表达42。准备幼崽进行无菌手术，并将含有病毒载体的溶液施用到外侧脑室。将显微注射（每侧1–1.5μl）横向为0.25 mm，向矢状缝合线横向，冠状缝合线0.50–0.75 mm的尾to骨和距颅骨表面的2 mm腹侧。注射后，幼崽被放在乱扔垃圾中，并在他们的家中送回母亲。注射后3-4周进行成像实验。 　　为了击败A2b受体表达，用floxed adora2b基因（Adora2bflox/flox; p0 – p2; p0 – p2或3-5个月大26岁）的小鼠的海马星形胶质细胞转导至26岁），以表达使用adeno与adeno相关的VIRAL VIRAL VIRAL VIRAL VIRAL VECTORAL AAVECRAP AAVECRAL AAVEC11 AAV5-GFPAP-GFPAP-GFPPPPPPPPPPPPPPPFPPFPPFPPFPPFPPFPPFPPFPPFPPFPPFPFPPPPPICICEREREREABiolabs）。用病毒载体AAV5-GFAP-TDTOMATO（宾夕法尼亚大学矢量核心）的星形胶质细胞的转导被用作对照。如上所述，向新生小鼠注射病毒载体。为了传递成年小鼠的星形胶质细胞，用异氟烷（5％诱导，2-3％的维持量，在富含O2富集的空气中）麻醉动物。通过缺乏对爪子捏的戒断反应，保持了足够的手术麻醉深度。将动物的头部固定在立体定位框架中，进行了中线背切口，以露出头骨表面。进行小颅切开术，并用AAV5-GFAP-EGFP-ICRE载体或AAV5-GFAP-TDTOMATO载体的AAV5-GFAP-EGFP-ICRE载体或AAV5-GFAP-EGFP-ICRE载体的每侧进行一份显微注射。微型注射（以0.1μlmin -1的速率给定的0.3–0.5μl）使2.0毫米的骨，侧面1.5毫米，距bregma腹侧1.5毫米。显微注射后，缝合了伤口。对于术后镇痛，动物接受了丁丙诺啡（皮下为0.5 mg kg-1）。手术后未观察到并发症，动物正常体重增加。 　　海马星形胶质细胞中[CAMP]和PKA活性变化的光学记录在急性或器官型脑切片中进行，放置在安装在Olympus FV1000显微镜或fmtosmart系统阶段的定制流通记录室中，将其与Ti：Sapphiai lasiai lasemai laseys（septrey and）rase（septrey septrie and rase）相连。用于检测CFP和YFP荧光的发射过滤器。记录在大约33-35°C的ACSF中进行，充满95％O2和5％CO2（pH 7.4）。对于刺激Schaffer侧支纤维刺激之前和之后，在海马侧和之后的星形胶质细胞中[CAMP]或PKA活性的时间录制（以下详细描述），使用Immersion×25 Olympus（NA 1.05）收集了512×512 Pixel框架（频率1 Hz）的图像。使用相同的实验设置进行了对照光学记录，而无需使用Schaffer侧支纤维刺激。在整个实验过程中，激光功率强度保持在4 MW以下。 　　如前所述42,44,45进行了急性海马切片中的电生理实验。将切片放置在装有Olympus BX51WI直立显微镜（Olympus）阶段的录音室中，该阶段配备了Lumplanfl/IR 40×0.8物镜与红外DIC成像系统和Evolve 512 EMCCD摄像头（PhotoMetrictics）耦合。荧光源是X-Cite Intelli灯（管腔动力学）。使用Micromanager 4.1（ImageJ插件）软件和各种数字变焦获取宽场荧光图像，以可视化转导的星形胶质细胞。使用同心双极电极（脉冲宽度为100μs； 20–300μa振幅，对应于饱和响应的三分之一），刺激了Schaffer侧支纤维。突触反应是由Schaffer侧支纤维刺激的列车诱导的，该刺激由五个在20 Hz处施加的脉冲组成，并相距50 ms。使用玻璃电极（1-2MΩ）记录了诱发的场兴奋性突触后电位（FEPSP），该玻璃电极（1-2MΩ）位于CA1区域中的刺激电极的距离超过200μm，显示了转基因的强星形胶质细胞表达。在典型的实验中，将诱发的FEPSP记录至少60分钟。 　　CA3-CA1途径中的突触长期增强（LTP）是由Schaffer侧支纤维32,42,45的高频刺激（HFS）诱导的。首先通过低频Schaffer侧支纤维刺激（每30 s 20 Hz施加5个脉冲的火车）对基底突触传播进行测试，并用诱发的FEPSP的记录进行15-20分钟的记录。然后将HFS应用于诱导LTP，该协议由三列刺激（100 Hz的100个脉冲）组成，并以60秒的间隔应用。LTP诱导后，将FEPSP记录为60-90分钟。在这些实验中，将Picrotoxin（100μM）和CGP-52432（5μM）添加到浴溶液中以阻断抑制性传播。记录的信号被放大（多捕获700B），并使用PCLAMP 10.2软件（分子设备）进行处理。录音被过滤和数字化；在每个脉冲序列中的第一个诱发响应中测量了FEPSP斜率。 　　使用安培酶微电极生物传感器（Sarissa Biomedical）46,47,48在急性脑切片中记录乳酸和腺苷。将传感器直接接触与在35°C的流动室中的高架网格上放置的薄片表面。如前所述46,47，使用了无效传感器（缺乏酶）和乳酸或腺苷生物传感器的双记录构型。无效传感器用于确定是否检测到任何非特异性电活性干扰物并混淆了测量值。从乳酸或腺苷生物传感器电流中减去无效的传感器电流，并使用所得电流轮廓来计算释放的分析物的量。在某些实验中，同时记录了腺苷和乳酸信号。在记录之前和之后，用已知量的乳酸或腺苷校准了生物传感器（在记录室（在相同温度，ACSF组成和渗透压条件下）的灌注液中校准。初始校准和最终校准的平均值用于将传感器电流的变化转换为乳酸或腺苷浓度的变化。 　　使用病毒载体转导原代培养的星形胶质细胞，以表达cAMP的遗传编码的荧光传感器（Epac-SH187（参考文献14）），PKA活性（AKAR4（参考文献15）），胞质NADH-NADH – NADH – NAD+ REDOX+ REDOX状态（Peredox28）or glucose（Peredox28）or glucose（peredox28）or glucose（flip12glu-700 0000；转导后3天后将细胞与病毒载体孵育12小时，并在实验中使用。Optical recordings of changes in [cAMP], PKA activity, [glucose] and NADH–NAD+ redox state in astrocytes were performed using an inverted wide-field Olympus microscope equipped with a ×20 oil immersion objective lens, a cooled CCD camera (Clara, Andor, Oxford Instruments), a Xenon arc lamp, a monochromator and an Optosplit (Cairn Research).记录在32–34°C的定制流通室中以95％O2饱和和5％CO2（pH 7.4）进行记录。ACSF室灌注速率为1 ml min -1。为了记录FRET信号的变化（CAMP，PKA活性和葡萄糖传感器），应用了415/10 nm的激发灯，并记录了荧光发射的470/24和535/30 nm。为了记录胞质NADH -NAD+氧化还原状态的变化，Peredox传感器用405/10 nm和575/10 nm的光激发，并在535/30 nm和630/35 nm处记录荧光发射。 　　为了诱导大脑星形胶质细胞中有条件的A2b受体敲低，将带有Loxp flank的Adora2b等位基因（Adora2bflox/Flox）26的小鼠与表达CRE/CRE/ERT2的诱导形式的小鼠交叉，该小鼠在控制的是星形胶质细胞特异性ALDH1L1 LEDH1L1 PLOSERERERS29下。先前已经描述了ALDH1L1CRE/ERT2小鼠的重组特异性。通过从耳朵DNA活检获得的PCR基因分型组织组织繁殖。他莫昔芬（溶解在玉米油中的100 mg kg -1；每天连续5天注射腹膜内（i.p.）给adora2bflox/flox：adora2bflox/flox/flox：小鼠：12-16周的年龄。在单独的adora2bflox/flox组中：和adora2bflox/flox：动物，玉米油作为媒介物对照。他莫昔芬治疗后4周检查了A2B受体在大脑中的表达。 　　通过Adora2bflox/Flox的脑组织的PCR评估了Adora2b基因座的基因组重组的特异性：以及用他莫昔芬治疗的小鼠Adora2bflox/flox。以下引物用于识别719 bp-l-long重组产物：重组前向5'-cagtgctgctattaaaaaaggg-3''和重组反向5'-gggtgactgcatagcatagcctagggagggaaac-3'。对于PCR基因分型，使用了以下引物：Adora2Bflox/Flox向前：5'-TTAAAAAGGTGATTCCCAGCAGCACGCACG-3';adora2bflox/flox反向：5'-GGTGACTGCATAGCCTAGGGAGAAAC-3';aldh1l1cre/ert2向前：5'-CTTCAACAGGTGCCTTCCA-3';Aldh1l1CRE/ERT2反向：5'-GGCAAACGGACAGAAGCA-3'。在对照动物的组织中未观察到Adora2b重组。 　　从Adora2bflox/Flox或野生型小鼠的大脑中分离出海马星形胶质细胞，并注入了AAV5-GFAP-EGFP-ICRE载体，以确定该模型中A2B受体缺失的有效性。这些动物被异氟烷过量，用冰冷的盐水对心脏灌注，并分离出海马区。将组织酶解离，以获得单个细胞的悬浮液。通过EGFP表达（ARIA II BD）确定星形胶质细胞。使用SONIPREP 150 Sonicator（Sanyo），通过低声裂解表达EGFP的星形胶质细胞的纯化部分。离心后收集上清液，用于通过ELISA定量A2B受体蛋白（E03A1281，Blugene Biotech）。将A2b受体蛋白定量标准化为每个样品中EGFP阳性细胞的数量。 　　At the end of the experiments, Adora2bflox/flox mice transduced to express iCre recombinase or tdTomato in hippocampal astrocytes were given an anaesthetic overdose (sodium pentobarbital; 200 mg kg−1; i.p.), the brains were removed, fixed in 4% paraformaldehyde for 12 h and sliced (20 μm).通过抗体标记辅助了在海马星形胶质细胞中转导为ICRE重组酶的小鼠大脑中EGFP表达的鉴定。切片后，将自由浮动切片与鸡与抗GFP抗体（1：500;抗GFP1020，Aves Labs或AB13970，ABCAM）在4°C下孵育12小时。然后将切片与二级抗奇异抗体Alexafluor 568（1：200; A-111041，Thermo Fisher）或Alexafluor 488（1：1,000; A-21441，Thermo Fisher）一起孵育2小时。用DAPI（Sigma）将脑部切片安装在载玻片上。使用蔡司800共聚焦显微镜获得冠状横截面的瓷砖图像。 　　To evaluate the cell specificity of transduction with the AAV5-Gfap-eGFP-iCre vector, astrocytes, oligodendrocytes, neurons and microglia were labelled using the following antibodies: rabbit anti-GFAP (1:500; 23935-1-AP, Proteintech), rabbit anti-MBP (1:200; MA5-35074, Thermo Fisher),Rabbit Anti-Neun（1：200; AB236870，ABCAM）和兔抗IBA1（1：200; GTX100042，Genetex）。二级抗兔抗体Alexafluor 568（1：1,000; 175470，ABCAM）用于鉴定转导的细胞。 　　用AAV5-GFAP-EGFP-ICRE或AAV5-GFAP-TDTOMATO转导的Adora2bflox/Flox小鼠制备的星形胶质细胞培养物用PBS洗涤两次，并在冰冷的液压缓冲液中收集两次，并用蛋白酶和磷酸酶抑制剂（热磷酸酶抑制剂）（热蛋白酶抑制剂）（热蛋白酶）（热蛋白酶）。样品被冻结，超声处理并以14,000 rpm离心；提取物的蛋白质含量由Pierce BCA蛋白测定法（Thermo Fisher）确定。然后将25微克蛋白质的蛋白质分离在无污渍的无染色聚丙烯酰胺凝胶（10％）（Bio-Rad）上，在变性和还原条件下。使用紫外线粉末蛋白暴露于紫外线3分钟后，在凝胶中可视化总蛋白水平。然后将蛋白质转移到聚偏二氟化物（PVDF）膜（Bio-Rad）中，该膜与5％的非脂肪牛奶一起孵育。接下来将膜与在5％BSA中稀释的主要抗体：兔抗A2BR抗体（4μgml-1; AB1589P，Merck Millipore）和小鼠抗肌动蛋白抗体（1：5,000; 3700; 3700，细胞信号技术），随后是纯化物种 - 固定剂（HRES） - 抗肌动蛋白抗体（1：5,000; 3700; 3700; 3700; 3700; 3700; 3700;二级抗体（1：5,000；抗兔子HRP，SC-2054，Santa Cruz和Anti-Mouse-HRP，SC-2005，Santa Cruz）。基于Luminol的Pierce ECL Western印迹底物（Thermo Fisher）用于检测HRP活性。扫描X射线膜后，使用ImageJ定量蛋白质条带密度。 　　使用定量的实时PCR（RT – QPCR）测定法用于确定adora2b表达在Adora2bflox/Flox小鼠的海马组织中的表达水平，这些小鼠转导至ICRE重新组合酶或TDTOMATO在星形胶质细胞和Adora2bflox/flox/adora flox中的Adora2bflox/adora2bfffffffflox/flox：and andoxbffffffflox：MOM.MOM.MOM.MOM.MOM.MOM。根据制造商的协议提取了总RNA，纯化，纯化（Rneasy Mini套件，74106，Qiagen），并使用定量逆转录套件（205311，Qiagen）进行反转录。使用Taqman Universal Master Mix II（4440040，Thermo Fisher）在20μl体积中进行PCR，最终体积为9μlCDNA，相当于25 ng的RNA，每反应样品模板。使用Taqman分析（Adora2b，MM00839292_M1，61 bp Amplicon长度，Thermo Fisher）作为检测方法和Agilent Technologies ARIA MX实时PCR系统（Agilent）进行PCR。使用比较CT方法（∆ΔCT）对Adora2b表达进行定量，并作为任意表达单位，标准化为泛素C基因的表达（MM01201237_M1，92 bp amplicon长度，Thermo Fisher）。 　　小鼠脑的单细胞RNA-seq数据是从林纳尔森集团（Karolinska Institutet; http://mousebrain.org/）的公开数据库中获得并维护的。数据库的原始报告中详细描述了细胞解离，单细胞RNA-seq和质量控制方法。使用r（v.4.2.2，“无辜和信任”）中的Seurat软件包49进行数据处理和可视化。从50,478个细胞中获得了27,998个基因的表达数据，从50,478个细胞中获得了组合的小鼠皮质细胞RNA-seq数据集。分析中包括所有显示出大于200和少于4,000的细胞，线粒体RNA的一定比例少于30％。其余的是49,703个细胞，其平均UMI计数（观察到的成绩单的绝对数量； NCOUNT的绝对数量）为3,124.92，Nfeatures（每个细胞基因）为1,592.39。然后将数据归一化并缩放到每个单元格至10,000个转录本。FindVariableFeatures函数50用于识别主要成分分析（PCA）中使用的细胞之间的4,000个最大基因。在PCA之前，将数据缩放为线性转换，以确保在随后的分析中给所有基因均等。然后，PCA对缩放数据进行降低，直到并包括前100个已识别的主组件。肘图用于确定有效数量的主成分数量，该组件被发现为75。使用这75个主要成分构建了K-Neareart邻居（KNN）图。为了聚集细胞，使用该尺寸51数据集的建议将Louvain社区检测方法（Louvain算法）与分辨率设置为2.0。统一的歧管近似和投影（UMAP） 用于根据用于聚类的相同的75个主要成分，在两个维度中可视化细胞簇，并产生63个不同的细胞簇。包含这些簇的细胞的身份由特征细胞特异性标记基因的差异表达确定。然后在确定的簇上绘制了adora2a和adora2b表达的分布。此外，为了确定限于样品中星形胶质细胞样细胞的adora2a和adora2b表达的分布，从初始投影中鉴定为星形胶质细胞鉴定为星形胶质细胞的细胞的表达数据被汇总并被整个数据集所描述的相同方法凝聚在一起。使用20个主组件构建KNN图，该组件将Louvain算法分辨率设置为0.8。最后，在所有已鉴定的细胞类型簇中确定了Adora2a和Adora2b表达的分布，其中簇至少有150个成员，其中簇至少有10％的所有纳入细胞，这些细胞被发现对adora2a或adora2b呈阳性。 　　小鼠是从他们的家笼子中取出的，用异氟烷过量终止麻醉，并用95％O2饱和和5％CO2饱和的冰冷的ACSF经心经科灌注。大脑在液氮中迅速分离，并在液氮中捕捉冻干。在每种情况下，将动物从其栖息地去除动物到制备冷冻样品的准备时间不超过5分钟。 　　如前所述提取来自脑组织的小分子。简而言之，将冷冻的脑样品（100-150 mg）转移到2 ml软组织均质化管（CK14，先例）中，将保存在干冰上，并将0.6 mL预冷的甲醇：氯仿（2：1 V：V）添加到样品中。将样品转移到珠子搅拌器（先例）中，并均匀（在从干冰中取出1分钟内以保持代谢物概况）两次，每分钟10,000发子弹。随后，将0.2 mL的水和0.2 mL的CHCL3添加到每个管中。样品混合涡流，以13,000克离心10分钟。将所得的顶水层等分为微管，在SpeedVac（Savant; 30°C，隔夜，VAQ设置）中干燥，然后保持在-80°C，直至测定。通过混合每个样品的50 µL水性层来制备“汇总质量控制”样品。在35 µL的水中重构样品，并使用Xevo TQ-S坦链质量光谱仪和配备有CTC自动放电器（Waters）配备的XEVO TQ-S TANDEM质谱仪和Aceruster Ultraperformance液相色谱液量液（Waters），使用XEVO TQ-S TANDEM质谱仪和Acker Ultrapermance液相色谱管理器，并使用XEVO TQ-S TANDEM质谱仪和Abiver tq-S Tandem质谱仪进行重组，并通过离子配对液相色谱 - 质谱法（LC – MS）53进行分析。使用水的电源离子化以负离子模式和色谱法获取数据，并使用水HSS T3色谱柱（1.8 µm，2.1×100 mm），使用10 mM tributylamine + 15 mm乙酸的二元溶剂系统（作为流动相位A）和80％甲醇 + 20％Isopopopanol（如流动相位）（与流动相位b）一起使用二元溶剂系统，并带有渐变型。样品处理顺序是随机的。进行双毛坯（水）和单个空白的注射以确保系统稳定性，并确定结转和溶剂干扰峰。在运行开始时注入了汇总的质量控制样品，然后在整个运行期间每次注射一次， 在整个分析会议上监视仪器稳定性。合并的质量控制样本用于评估标准化方法。在样品制备和质谱分析过程中，研究人员对实验样品的身份视而不见。补充表1中提供了所有注释代谢物和原始数据的列表，并在https://doi.org/10.25345/c5x05xq2b中找到。 　　使用Skyline54处理LC -MS数据。根据M/z的内部数据库和外部标准的保留时间，对手动策划的峰进行注释；仅将通过实验离子比的峰（存在多个产品）进行了整合，然后将峰面积值导出。使用概率商对所有数据进行标准化，并使用R（v4.1.3）进行分析。代谢物的相对水平是平均中心的，并使用R.多变量分类模型调整了方差。使用ROPLS R软件包（v.1.26.4）的部分最小二乘二歧视分析（PLS-DA）构建了多变量分类模型（v.1.26.4），使用七倍的交叉变量为10,000置换量。代谢组学途径富集分析是使用代谢途径的SMPDB数据库进行的，代谢途径的SMPDB数据库，前五名代谢物区分PLS-DA模型中的实验组作为输入。 　　实验是在昏暗的光条件下在一个孤立的房间中进行的。在测试之前，研究人员每天至少在主要实验前1周处理动物。在实验前1小时，他们的家笼中的动物被带入行为测试室。首先，允许每只小鼠探索一个空的正方形实验室（40×40×40 cm），持续5分钟。将动物放置5分钟，其中两个相同的物体对角线放在腔室的地板上，然后将动物送回家用笼子。1小时后，将动物送回测试领域，其中一个原始物体被一个新物体代替。通过使用摄像机和观众III软件（BioBserve）跟踪鼠标的鼻子来记录动物在竞技场中的行为。通过计算动物花费的时间以及在训练和测试过程中每个物体附近进行的探视频率来评估识别记忆。使用公式di =（在新颖对象上花费的时间 - 在熟悉的对象上花费的时间）/（花在熟悉的对象花费的时间+在熟悉的对象花费的时间）×100来计算歧视索引（DI）作为识别记忆的度量。 　　对于电极植入，用异氟烷（5％诱导，2-3％维持，在O2中）麻醉小鼠，并接受丁丙诺啡（0.5 mg kg -1，皮下皮下），以进行围手术镇痛。通过缺乏对爪子捏的戒断反应，保持了足够的手术麻醉深度。在动物的头部以立体定位框架中，进行了中线背面切口，以露出头骨的表面。使用不锈钢螺钉将脑电图和EMG电极校长（峰值技术）固定在颅骨上，并使用银环氧树脂来获得最佳的电气连接。将两个EMG铅插入颈部肌肉中，并用牙科丙烯酸固定校长。经过10天的恢复期在具有12-12光周期的房间中，将小鼠放在单独的有机玻璃圆形记录笼（Pinnacle Technology）中，并无限获得水和食物。校长连接到轻巧的脑电图前置放大器（峰顶技术），以实现无限制的运动。在经过3天的习惯期之后，使用Sirenia软件（Pinnacle Technologn）以400 Hz采样EEG信号。使用动物软件（Kissei comtec）在4-S时期对睡眠阶段进行评分。通过低振幅，高频脑电图和高EMG活性来确定清醒周期。NREM睡眠是通过高振幅，低频脑电图鉴定的，具有最小的EMG调制。REM睡眠是通过低振幅，异步的EEG鉴定出的，具有低或缺乏EMG活性。 　　使用IQ3软件（V6.3； Andor，Oxford Instruments）或Olympus Fluoview软件（V4； Olympus）获取成像数据，并使用Fiji（ImageJ）进行分析。使用Power 1401接口获取生物传感器记录，并使用Spike2软件（V7； Cambridge Electronic Design）进行分析。使用PCLAMP软件（V10.2）获取并分析电生理数据。使用Origin 2019软件（v9.6）和GraphPad Prism软件（V8）对数据进行统计分析。通过Shapiro -Wilk正态性测试分析数据的分布。在比较两组以上的数据时，使用单向或混合模型ANOVA或KRUSKAL-WALLIS测试（对于非正常分布数据）分析了分组数据。当将实验组与一个对照组进行比较时，在将实验组与一个对照组进行比较时，或通过对两组之间的多次比较进行比较时，单向方差分析之后进行了事后测试。使用t检验或Mann-Whitney U检验（对于非正态分布数据）进行了两组在实验中获得的数据的比较。当在相同组中进行多次测量，然后进行Tukey的事后多重比较测试，通过重复测量方差分析通过反复测量方差分析EEG数据。数据报告为个体值，平均值±S.E.M.或盒子和旋风图。在盒子和旋风图中，中央点表示均值，中央线表示中间线，盒子限制表示上四分位数，晶须延伸至四分位数的四分位间距范围为1.5倍。在图传奇中提供了所应用的统计测试的详细信息。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。