从大气氢中提取细菌能量的结构基础

　　在整个研究过程中，在八次不同的情况下，将HUC从Smegmatis细胞中纯化。纯化的HUC（每升培养）的产率在纯化之间差异为五倍。HUC低聚物和低分子量物种的相对丰度（扩展数据图1A）在纯化之间变化了大约两倍。从每个纯化中对HUC进行SDS -PAGE和活性染色（n = 8）。HUC低聚物中的HUC，HUCL和HUCM亚基的丰度（扩展数据图1B）及其活性（扩展数据图1C）在纯化之间是一致的，因此显示了单个纯化的凝胶。来自不同纯化的HUC低聚物用于下游酶促，电化学和光谱分析。本研究的统计方法不用于预先确定样本量。由于不适合此类研究，因此不使用盲和随机化。 　　野生型和ΔHUCM细胞裂解物中HUC活性的天然页面分析使用源自独立生长的培养物（n = 3个生物学重复）的细胞裂解物进行了三次。所有重复都显示出可比的相对活动和带尺寸。显示了单个代表性凝胶（扩展数据图1E）。 　　在单批纯化的HUC（n = 3个技术重复）上进行了三次进行HUC熔化温度的差异扫描实验，并在样品之间进行一致的结果。鉴于HUC低聚物的一致纯度和活性，对单个样品的分析足以确定酶的熔化温度。显示了单个实验的代表性曲线（扩展数据图1D）。 　　HUC H2消耗实验是对每种电子受体（NBT或Menadione）（n = 4，生物学重复）的4种不同的HUC制剂进行的，每种情况中使用了3个重复的小瓶（n = 3个技术重复）。在生物学和技术重复之间获得的数据都是一致的。大肠杆菌Hyd1 H2消耗实验是对单个酶制剂（n = 1个生物学重复）进行的，使用了3个重复的小瓶（n = 3个技术重复）。图1a，b和扩展数据图1F显示了来自单个酶制备的数据，并同时收集了有关所有样品的数据。数据表示为3个技术重复（n = 3）的平均值，其中误差线显示S.D.含有无酶的对照小瓶没有显示H2的消耗或损失，并包含在每个实验中，具有2或3个技术重复（n = 2或3）。 　　HUC氧耐受性和电子受体依赖性实验在单独的HUC纯化（n = 3，生物学重复）上进行了3次，每种HUC样品的每个O2浓度或电子受体收集了3个单独的电极痕迹（n = 3，技术复制）。对于Menadione活动实验，使用该化合物时仪器噪声增加（n = 5，技术重复），进行了5次技术重复。在生物学和技术重复之间获得的数据都是一致的。显示了单个HUC样品的每种条件的三个重复（Menadione的五个）的平均值，显示了误差线。（图1C，D）。 　　使用单个酶制剂记录了100％H2中HUC的循环伏安图（图1E）（n = 1个生物学重复）。记录了两张固定的HUC膜（n = 2个技术重复），每胶片至少扫描了两次。在技​​术重复之间获得的数据是一致的。每个实验中包括两个没有固定酶的对照膜（n = 2个技术重复），每次都进行了两次扫描。在每种酶（n = 1，生物学重复）的单个制备中，对HUC，HYD1和HYD2的环状伏安法进行了10 ppm至5％H2（n = 3个技术重复）（图1F和扩展数据图2）。这些实验中使用的HUC是从不同的纯化到100％H2实验的纯化。在蛋白质膜电化学中很常见，发现在膜制备中较小的差异引起的不同膜之间的绝对酶覆盖率变化。因此，比较不同蛋白质膜之间电化学的绝对电流是不合理的。但是，技术重复之间的当前趋势会随着H2局部压力的变化而响应的趋势。为了确定HUC的发作电位，确定了两种HUC蛋白膜的发作电位的三个客观读数的平均值，如显示S.D的误差条所示。（扩展数据图2A）。 　　从2个单独的纯化（n = 2个生物学重复）对HUC上进行冷冻成像。从每个纯化中收集了2,226张和3,113张图像，并在扩展数据中使用了自由和膜相关的HUC的单个代表性图像图3A。在每个数据集上独立执行二维和三维重建。 　　在单个酶制剂（n = 1个生物学重复）上进行EPR实验，在闪光冷冻之前在H2或AR下孵育。记录了一次每个单独的功率和温度设置（n = 1技术复制），每个频谱表示4次扫描的平均值（图3C，扩展数据，图5b – d）。考虑到交叉相关时功率和温度依赖性的一致性，这对于手稿中得出的结论就足够了。 　　对单个酶制剂进行FTIR实验（n = 1个生物学重复）。H2暴露后降低状态的群体和暴露于空气时的Ni-B形成，至少三个个体衰减的总反射率（ATR） - ftir光谱样品样品制剂（n = 3，技术复制），导致相似的结果（图3D和扩展数据，图8a – d，H）。这些氧化还原状态种群之间转移的动力学在一次样品制备中记录（n = 1个技术重复）（扩展数据图8E）。 　　由于分析和样品数量约束的定性性质，通过LC – MS（图4E）鉴定了LC-MS中二氢瘤酮-9（图4E）。虽然使用这些数据的占用量（补充图5）是定量的，但该分析的目的主要是证明信号与对配体预期的信号是一致的，该配体仅需要单个复制。 　　对每个条件模拟进行了3次分子动力学模拟（n = 3）。累积气体占用图作为这些模拟的平均值，上面显示了S.D.（扩展数据图6b和7b）。 　　可以通过以下PDB登录代码（5AA5、2FRV，4U9H，6EHQ，4C3O，4C3O，3AYX，5MDK）访问本研究中使用的公开结构坐标。 　　Smegmatis M. Mc2155及其衍生物是在补充0.05％（w/v）Tween 80（LBT）的溶酶体肉汤（LB）琼脂平板上生长的。在肉汤培养物中，smegmatis在LBT中生长，或添加了0.2％（w/v）甘油，0.05％（w/v）Tyloxapol和10 mM Niso4（HDB）的Hartmans de Bont Minimal培养基。大肠杆菌维持在LB琼脂板上，并在LB肉汤中生长。用于克隆实验的选择性LB或LBT培养基含有5μgml -1的庆大霉素，用于M. smegmatis，而大肠杆菌则含有20μgml -1。除非另有说明，否则将培养物在37°C的旋转摇动下以150 rpm的速度孵育。补充表4列出了Smegmatis及其衍生物和大肠杆菌的菌株。 　　对于HUC产生，使用Smegmatis MC2155菌株PRC1进行蛋白质表达，该菌株缺乏甘油反应调节剂GYLR（GYLR LEU154→FRAMESHIFT）和HHY氢化酶（HHYS INACTIVATION）49,50。为了促进HUC纯化，如先前所述51所述，在小亚基（MSMEG_2262，HUCS）的N末端（MSMEG_2262，HUCS）插入了2×strepii标签。Genewiz合成了一种等位基因交换构建体Hucs-2×strepii（2656 bp），并将其克隆到分枝杆菌穿梭质粒PX33的SPEI位置中，以产生构建体PHUC-2×strepii（补充表4）。Phuc-2×strepii在大肠杆菌DH5α中传播，并通过电穿孔转化为野生型M. smegmatis mc2155 Prc1细胞。庆大霉素用于选择性固体和液体培养基中以传播PX33。为了允许允许温度敏感的载体复制，将转化子在28°C的LBT庆大霉素板上孵育，直到可见菌落（5-7天）。将最终的儿茶酚阳性菌落在40°C的LBT庆大霉素汤中取代了3-5天，然后从肉汤中稀释到新鲜的LBT庆大霉素板上，在37°C下在37°C下孵育3-5天，以通过侧面的Chromosions促进重组质粒的整合。第二个重组事件是通过补充10％蔗糖（w/v）的LBT中的儿茶素反应性和耐霉素抗性菌落来促进的3-5天，然后将其稀释到补充10％蔗糖（W/V）的LBT琼脂平板上（W/V） 并在37°C下孵育3-5天。随后通过PCR筛选了对庆大霉素敏感的和儿茶酚 - 无反应性菌落，以区分野生型逆转与HUCS-2×strii突变体。PCR呈阳性的HUCS-2×strii插入的菌落被指定为M. smegmatis MC2155 Prc1 Hucs-2×strii，并用于后续实验。补充表4列出了用于筛选的引物。使用相同的PRC1母体菌株和对HUC的2x strepii标记的相同的PRC1父菌株和程序删除HUCM。使用了由HUCM两侧的约1,000 bp基因组序列组成的等位基因交换构建体。 　　M. smegmatis MC2155 Prc1 Hucs-2×Strii细胞在大量（10–20 L）的HDB中传播，直到24小时到固定相24小时。通过离心收集细胞，并将补充有0.1 mg ML -1溶菌酶，0.1 mg ML -1 DNase，1 mM MGCL2和蛋白酶抑制剂鸡尾酒鸡尾酒片剂添加到裂解缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl pH 8.0）中。通过细胞破坏者（乳液C-5）裂解细胞，并通过30,000g离心15分钟以离心去除细胞碎屑。将生物素阻塞缓冲液（IBA）添加到澄清的细胞裂解物（每25 ml裂解物1 mL）之前，然后将其加载到1 mL链球链球柱（Cytiva）上，并用裂解缓冲液对柱进行广泛洗涤，然后用绑定的HUC用裂缝 + 2.5 mm desthiobiotin洗脱绑定的HUC。使用100 kDa MWCO离心浓缩剂（Amicon，Millipore）通过SDS-PAGE（AMICON）确定链球菌中的HUC含量分数。将浓缩的HUC加载在超糖6 10/300色谱柱上（细胞tiva），通过SDS和天然页面确认含有寡聚HUC的馏分，合并，并浓缩至〜6 mg ml-1，然后在液体N2中闪烁，并在-80°C下燃烧液位。通常，纯化产生了HUC复合物的10–20μgL -1。 　　根据制造商的说明，对于SDS-PAGE和本地页面，分别以4–12％SDS-PAGE和本机页面4-16％凝胶（Invitrogen）在螺栓上运行样品。通过使用比色电子受体NBT氢化氢酶，通过熟悉蛋白质凝胶染色（牛头蛋白酶）和氢化酶活性对总蛋白进行染色。对于NBT活性染色，将凝胶在50 mM Tris，150 mM NaCl pH 8.0中孵育，在厌氧罐中补充了500μMNBT，并用7％H2厌氧混合物修饰。根据活性水平进行孵育30分钟至12小时。基于还原NBT的紫色颜色鉴定出表现出氢化酶活性的条带。对于蛋白质印迹，使用Transblot Turbo Semidry转移设备（Biorad）25 V将蛋白从SDS -PAGE或天然页凝胶中转移到硝酸纤维素膜中，持续30分钟。转移后，将含蛋白质的硝酸纤维素膜用PBS（pH 7.4）中的3％（w/v）BSA封闭，并以0.1％（v/v）Tween 20（PBST）阻塞。将硝酸纤维素膜在20 mL的PBST中洗涤3次，并最终重悬于同一缓冲液的10 mL中。然后以1：100,000的稀释度添加链球菌 - tactin HRP结合物。根据制造商的规格，使用ECL Prime检测试剂盒（Cytiva）通过化学发光检测到结合的链球菌 - tactin HRP，使用Chemidoc（Biorad）可视化印迹。 　　用纯化的HUC消耗H2，用单密度H2微传感器极化为+100 mV，用纯化的HUC消耗1小时。最初，用气体饱和缓冲液（50 mm Tris，150 mM NaCl，pH 8.0）中的已知H2标准标准为0％，1％和10％H2（v/v）校准了电极。该缓冲液是通过首先用100％氮气冒泡所有缓冲液1 h来制备的，以去除所有氧气，然后通过去氧缓冲液将100％H2（v/v）冒泡10分钟。在脱气和重新调用之前，所有缓冲液都包含电子受体，达到了200μM的最终浓度（Menadione，NBT或Benzyl Viologen）。对于每次读数，将含有电子受体的1％（8 µM）H2液的缓冲液添加到微呼吸法测定室中，最终浓度为1％H2。随后将电极放入腔室以平衡。一旦平衡（大约10分钟），将BSA（0.3 mg ML -1）和HUC（在0.3 mg Ml -1 bsa中为1-3 nm）通过针添加到腔室中，以免破坏溶液中的气体平衡。使用SensorTrace Suite v3.4.00测量H2浓度的变化，并从HUC的添加到完全的H2消耗来测量H2消耗的线性速率。在八个时间点上，HUC的H2消耗线性消耗率在大约2.5μmH2至0.0125μmH2之间计算。这些H2消耗的速率用于绘制Michaelis-Menton曲线的绘制，并在存在不同电子受体以及HUC的最大速度的情况下计算HUC特异性活性。 　　使用修改后的叶萃取准备样品进行LC -MS分析。简而言之，用2000 µl的2：1氯仿处理纯化蛋白质（〜57 µg）的100 µL溶液：甲醇（v/v），然后将混合物摇动10分钟，并允许再耐用50分钟。加入四百微米的水，并振动混合物10分钟，然后允许样品站立直到两个相完全分离。然后将富含氯仿的相位转移到2 mL样品小瓶中，并在氮气流下除去溶剂。将所得的残留物在100 µl的2：1氯仿中重构：甲醇V/V并转移到200 µL样品插入物中，再次除去溶剂，并在LC溶剂A的7：3混合物中重构A：LC溶剂B（V/V）。使用Dionex RSLC3000 UHPLC（Thermo）分析样品，并使用C18柱（Zorbax Eclipse Plus C18快速分辨率HD 2.1×100 mm×100 mm×1.8μm，Agilent）和Biareny溶液系统使用C18列（Zorbax Eclipse Plus C18快速分辨率HD 2.1×100 mm×100 mm×100 mm×100 mm×）;溶剂A = 40％异丙醇和溶剂B = 98％异丙醇均含有2 mM甲酸和8 mM铵甲酯。线性梯度时间，％b如下：0分钟，0％；8分钟，35％；16分钟，50％；19分钟，80％；23分钟，100％；28分钟，100％；30分钟，0％；32分钟，0％。流速为250 µl min -1，柱温度为50°C，样品注入体积为10 µL。质谱仪以70,000的分辨率在极性开关模式下运行，并具有以下电喷雾电离源条件：喷雾电压3.5 kV；毛细管温度300°C；鞘气34;Aux Gas 13;清扫气体1和探测温度120°C。 　　通过比较包含标准MQ9的单个样本来计算与HUC相关的MQ9（II-H2）的占用率。MQ9是与MQ9（II-H2）最接近的结构类似物（仅在第二种异丙基单元中存在额外的双键），该结构类似物是市值可获得的，并购自多伦多研究化学品。在含有452.64 ng的MQ9的标准样品中，MQ9的铵加合物的峰面积为7.40×109，蛋白质样品中MQ9（II-H2）的铵加合物的峰面积为6.77×109（补充图5）。假设MQ9（II-H2）和MQ9标准的响应是等效的，则可以估计414 ng蛋白质样品中MQ9（II-H2）的量。蛋白质样品含有57 µg的HUC，对应于68.4 pmoles（HUC的MW为833 kDa）。由于每个HUC复合物在完全占用时有八个MQ9（II-H2），因此对应于MQ9（II-H2）的547.2 pmoles或430.4 ng（MQ9（II-H2）= 786.63 g mol-1）（II-H2）。因此，MQ9（II-H2）中HUC的占用率估计为96.2％（414 ng / 430.4 ng）。如果MQ9（II-H2）在HUC结构中观察到的结合位点之外结合，则这些位点的实际占用率将较低。但是，鉴于HUC头组的密度高质量，我们希望在这些地点存在的MQ9（II-H2）占样本中的大多数。 　　切除源自HUC复合物的SDS-PAGE上的18 kDa频带，并从凝胶基质中提取。杀伤性后，用Tris（2-羧乙基）磷酸（Pierce）还原蛋白质，用碘乙酰胺（Sigma）烷基化，并用质谱级胰蛋白酶（Promega）消化。通过LC -MS/MS分析提取的肽在最终的3000 RSLCNANO System（Dionex）上，该系统与配备纳米喷雾源的Orbitrap Fusion Tribrid（Thermofisher Scientific）质谱仪结合使用。首先将肽加载并在一个好评的PEPMAP陷阱柱上（0.1 mm ID×20 mm，5 µm），然后在一个30分钟的线性梯度中在4-36％acetonitrile/0.1％的30分钟线性梯度中在一个好评的PEPMAP分析柱（75 µm ID×50 µm，2 µm）上分离。Orbitrap Fusion Tribrid以数据依赖性采集模式运行，固定周期时间为2 s。Orbitrap Full MS1扫描设置为调查375–1,800 m/z的质量范围，分辨率为120,000，为M/z 400，AGC目标为1×106，最大注射时间为110 ms。选择单个前体离子进行HCD碎片化（碰撞32％），然后在Orbitrap中使用60,000的分辨率以M/z 400的分辨率，5×105的AGC目标和最大注射时间为118 ms。一次发生后，动态排除设置为±10 ppm 10 s。使用Byonic（Proteinmetrics V4.3）对涵盖M. smegmatis MC2155的蛋白质​​数据库进行处理。将前体的质量公差设置为20 ppm，并在0.6 Da下检测到片段离子。将氧化（M）设置为动态修饰，氨基甲甲基（C）作为固定修饰。仅报告仅报告肽和蛋白质降至0.01的错误发现率。 　　气相色谱实验用于测量纯HUC蛋白和表达HUC的smegmatis培养物对H2气体的消耗。对于纯蛋白实验，为了评估HUC用Menadione作为电子受体的H2氧化速率，5 mL缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0，0.3 mg ML -1 BSA）用200 µm Menadione以120 mL密封的SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SEALED SELUM VIAL。在大气中的气体混合物中用3 ppm H2冲洗小瓶的顶空，然后通过注射器加入100 nm HUC以开始反应。对于比较HUC和HYD1的H2氧化速率的实验，使用了相同的反应缓冲液，含有200 µM NBT代替Menadione，N2中使用了10或100 ppm H2的顶空，并添加了50 nm HUC或HYD1以开始反应。在实验之前，在N2中7％H2的大气中孵育18小时，通过孵育，在厌氧上添加到血清小瓶中，从而激活HYD1。在室温下孵育小瓶，并使用特定的时间间隔在脉冲放电氦电离检测器（TGA-6791-W-4U-2，Valco Instruments Company）中监测氢气浓度，直到不再观察到显着的H2氧化作用，或者已经达到了较小的限制。 　　为了确定HUC络合物的稳定性，使用Prometheusnt.48 DSF（纳米Emper）使用高灵敏度毛细血管从20到90°C进行热融化。监测330和350 nm时荧光变化的比率以确定蛋白质的展开。在含有50 mM Tris，150 mM NaCl pH 8.0的缓冲液中，用HUC浓度为0.2 mg ml -1进行熔化。 　　将样品（3 µL）施加到发光的超纤维超应油条（量化GmbH）上，并使用玻璃体标记IV（Thermofisher Scientific）在液体乙烷中闪烁，预备室的湿度为100％湿度和4°C。在以300 kV的加速电压下以50μmC2孔径的加速电压运行的泰坦旋钮显微镜（Thermofisher Scientific），在纳米杆EFTEM模式下以105 kx的倍倍放大，收集了数据。GATAN K3直接电子检测器位于Gatan量子能量过滤器后，以零能量损耗模式运行，缝隙宽度为10 eV，以获取无客观孔径的HUC复合物的剂量分型图像。收集了两个初始的HUC数据集，一个由2,226部电影组成的低浓度数据集（0.4 mg ml -1），以及一个由3,113部电影组成的中等浓度数据集（1 mg ml -1）。电影以硬件二键模式（以前​​称为K3摄像机的计数模式）录制，其物理像素大小为0.82Å像素-1，暴露时间为6 s，总剂量为66.0 e-Å-2，剂量率为〜7.5 e-pixel-1 s-1，剂量为〜7.5 e-pixel-1 s-1，其中已归类为60个单一量表。还使用相同的显微镜记录了进一步的高浓度数据集（4 mg mL -1），为9,868个显微照片，但在K3检测器上的165 kx较高放大倍率时，所得像素大小为0.5Å。将零损坏过滤的缝隙宽度设置为10 eV，并以4.37 e-pixel s-1的剂量速率收集图像。收集电影的时间为4 s，总剂量为60.4 e -Å -2，将其进一步分级为60个子帧。散焦范围设置在-1.3和-0.3μm之间。 　　使用UCSF MotionCor 1.0.4进行了运动校正所有数据集的显微照片，并且使用CTFFIND 4.1.8估算的对比度传输函数（CTF）参数，使用Relion 3.1.2（参考文献52）实现。 　　使用冰冻1.7.6确定粒子坐标，该模型使用从20个显微照片挑选的手动颗粒进行训练的模型53。使用Relion 3.1.2从显微照片中提取未链接的颗粒，然后将其导入CryoSparc 3.3.1以进行初始2D分类以去除不良颗粒，然后从头开始，然后进行初始型号的生成和3D细化54。将精制的颗粒重新放入3.1.2中，并进行CTF细化，然后进行贝叶斯抛光52。将颗粒重新插入CryoSparc 3.3.1中以进行最终的2D分类以去除残留的坏粒子，然后进行不均匀的3D共识细化，以在2.19Å处生成最终地图（傅立叶壳相关（FSC）= 0.143，金标准）。 　　使用直径为80Å的Gautomatch v 0.53（由K. Zhang开发）挑选HuCS2L2颗粒，并使用设置为20Å的挑选的颗粒之间的最小距离。将所得颗粒提取并进行4次，以56像素的盒子尺寸。将一小部分具有224个像素盒大小的未链接粒子进行2D分类，以排除噪声颗粒，然后选择其余部分，并使用CryoSparc v3.0.1（参考文献54）进行4个类别的3D Ab Intibe Model生成。对应于HUCS2L2亚基的类别的类显示清晰的C2对称性，并且使用C2对称性进行了均匀细化，导致了3.25Å的分辨率重建。如图3所示，所得的体积用作进一步分类和完整数据集进行进一步分类和完善的初始模型。在2D分类和异质性改进之后，从BINNED数据集中选择了与亚基相对应的粒子。然后，使用PYEM V0.5软件包中的CSPARC2STAR.PY脚本导出了来自异质改进的CryoSparc 3D对齐。在相关的情况下，使用进口颗粒的精制坐标重新提取了颗粒，而无需汇总。将它们重新提高到冷冻状态，并进行异质性细化，然后对应用C2对称性进行均匀改进。由此产生的重建的FSC由于使用Gautomatch的过度挑选而显示出粒子的重复。如上所述，将精制的粒子坐标导入属于关系中，并清洗以去除重复的颗粒。清洁的重新提取颗粒进行了一轮CTF细化，然后进行自动填充和贝叶斯抛光。将所得的抛光颗粒进口到CryoSparc和CTF细化中，并进行了CTF参数优化的不均匀细化，以达到1.67Å的最终全局分辨率 （FSC = 0.143，黄金标准），它接近数据集的Nyquist极限（1.64Å）。 　　A second dataset at higher magnification was collected to overcome the Nyquist limit imposed on the map resolution of dataset 1. The particles were picked, extracted, and binned as described above and in Supplementary Fig. 2. Multiple rounds of 2D classification, ab initio classification, and heterogeneous refinement was performed to retain only particles containing the full Huc oligomer.用HUCS2L2亚基图作为初始模型在bin的颗粒上进行均匀的细化，以将颗粒置于HUCS2L2亚基上。然后根据精制坐标重新提取这些颗粒，以相对于380像素的盒子大小。用C2对称性的均匀改进导致亚基重建图为2.15Å。此步骤确保了所有HUCS2L2颗粒的保留，并具有良好的信号噪声比。为了确保保留了与HUC低聚物相对应的所有与对称相关的HUCS2L2颗粒，将上述颗粒的较大的盒子大小重新提取上述颗粒，并重新缩放为128像素（4×BINNED）。将所得的粒子集对始于型模型产生进行，然后使用C4对称性进行均匀的细化，以产生HUC低聚物的4.10Å图。根据上一步的精制坐标重新提取颗粒，其盒子大小为576像素，然后重新缩放至288个像素（2×binned）。然后，将这些颗粒进行均匀的细化，然后进行CTF细化和CryoSparc中的不均匀细化，以产生2.05Å分辨率MAP54。然后将精制的粒子集重新将其重新放入属性中，并进行贝叶斯抛光。将所得的“光泽”颗粒提取到最终的576像素的盒子尺寸，没有任何套筒，并将其重新放入CryoSparc中，以执行对称性扩展和最终细化。重复的颗粒被排除在于保留153，359 HUC低聚物。将最终的颗粒施加了一轮精致，施加了C4对称性，得出的颗粒产生了2.19Å的地图。所得的精制颗粒是对称性的，并在CryoSparc 3.3.2内进行局部细化，而没有对称性，以产生2.16Å的HUCS2L2。将所得的VOL和颗粒对齐与C2对称轴，以利用HUCS2L2内的C2对称性。然后，用C2对称性对称对准颗粒进行完善，然后进行迭代全局CTF细化，按照粒子散热性的细化，然后进行Ewald球校正，并在最终的粒子散热性细化中进行最后一轮，以达到1.52Å（FSC = 0.143，金标准）的最终全局分辨率。 　　在数据集2的HUCS2L2亚基重建过程中，导致2.15Å映射的粒子集以512像素的盒子尺寸重新提取，并重新缩放为128像素（4×binned）。将所得的粒子集对2D分类进行，然后使用C4对称性进行初始模型的产生和均匀的细化，以产生4.10Å的HUC低聚物图。根据上一步的精制坐标重新提取颗粒，其盒子大小为576像素，然后重新缩放至288个像素（2×binned）。然后，将这些颗粒进行均匀的细化，然后进行CTF细化和冷冻Parc中的不均匀细化，以获得2.05Å分辨率MAP54。然后将精制的颗粒重新将其重新放入关系体中，并进行贝叶斯抛光，将最终的“光泽”颗粒提取到最终的盒子大小为576像素的最终盒子，而没有任何固定。这些颗粒具有三个类别的从头开始生成，以保留颗粒，这些颗粒显示出HUCM尾部区域的清晰密度。然后将选定的颗粒CTF精制并不均匀，以产生2.09Å的地图。使用Chimerax 1.3中的体积工具分离茎密度，并过滤至20Å，以得出CryoSparc55中局部细化的初始模型。使用初始模型生成了扩张的余弦软垫。使用嵌合体中的体积示踪工具确定茎附着在亚体主体上的坐标，并用于定义用于局部改进的新的支点点（补充图4）。两轮掩盖的局部细化导致改善与膜相关的茎区域的密度，如图所示，分辨率为5.7Å（无掩模）。最终的FSC计算出5.21Å（FSC = 0.143，黄金标准）的地图分辨率，但地图特征在视觉检查时的分辨率更为一致。 　　使用AlphaFold生成了HUC和HUCL亚基二聚体的模型，并使用Chimerax 1.3（参考文献56,57）将其停靠在高分辨率HUC二聚体图的一半中。使用COOT 0.92（参考文献58）将模型完善并重建为MAP密度。[Nife]，[3FE -4S]和与HUC相关的Menaquinone辅助因子从PDB下载和使用肘部包装中的肘部生成的定制约束，然后使用COOT59,60将其精制并改进地图。然后，使用phenix61中的真实空间改进来完善模型。一旦模型构建完成，模型是使用MAP对称工具扩展的对称性，并在Phenix Package60中使用Douse添加水。使用Chimerax56将精制的二聚体模型停靠到HUC低聚物图中，HUCM使用COOT58手动内置了一个亚基的可用密度，然后在Phanix和其他模型构建中进行了迭代的真实空间改进。一旦模型构建完成，模型是使用MAP对称工具在Phenix Package60中扩展的对称性。使用Molprobity62验证了模型质量。图像和电影是在Coot，Chimerax和Pymol56,58中产生的。使用Caver Code63确定了HUC和其他[Nife]氢化酶的气通道的位置和直径。 　　使用Alphafold建模使用Alphafold版本2.1.1在大规模M3计算集群中实现了57,64。提供了HUCM C末端区域（氨基酸80-189）的序列，并在多聚机模式下进行建模，并要求四个分子HUCM分子。比较了Alphafold产生的五个排名模型，以与用于进一步分析和数字生成的顶级模型一致性。 　　HUC氢化酶的1.52Å冷冻EM结构用于使用TIP3P67水模型的Charmm 36m Field65,66构建模拟系统。将钠抗衡管添加到溶液中，以中和系统电荷。建立了三组模拟，其中包含没有气体分子或含有250个氢或250个氧分子富含溶液中的氧气。将气体分子随机插入水相。每次模拟都以不同的起始速度和气体位置和每个系统进行三个独立的模拟。模拟以50 ns（野生型）或100 ns（突变体）进行。使用VMD软件进行分子可视化和分析68。金属辅因子的拓扑基于冷冻EM结构的坐标构建。先前的氢化酶辅助因子69的工作证明了在氢化酶之间结构相同的金属辅因子的可转移性。因此，从结构相似的Desulfovibrio Fructosovorans [Nife]氢酶69的研究中获取了金属辅因子键长的原子部分电荷和力常数。金属辅因子内键长和角的平衡值直接从冷冻EM结构中取出。分子动力学模拟以单个氧化还原态进行。根据先前的类似分析，选择了活性位点的现成活性Ni-Si形式和铁硫簇的氧化形式。[Nife]辅助因子在CN和CO配体以及铁原子和两个结合的硫原子之间的键约束。Lennard – Jones参数是从Charmm 36m65,66的Forcefiel中获取的， 除氰尿碳71外，从物理数据中获取的铁参数具有非零EPSILON值72。选择了Javanainen等人开发的QL分子氧模型。73被选择以更好地定义分子内的四极杆。氧原子给予质量和非零的Lennard-Jones参数以及部分电荷。一个无质量的虚拟位点OD1存在于两个氧原子的中点，用于携带中和电荷，从而模拟氧气四极中的电荷分布。同样，给予氢模型的质量和电荷分布与Hunter等人的工作相一致。使用gromacs v 2021.3模拟套件进行了分子动力学模拟。使用最陡峭的下降算法进行了能量最小化，然后使用结合梯度方法进行第二个最小化步骤，这两种方法都设置为250 kJ mol -1 nm -1的最大力。在310 K的NVT集合中进行平衡模拟。将位置约束用于蛋白质，辅因子和镁离子，并具有103 kJ mol -1 nm -2力常数为100 ps。在NPT集合中进行进一步的平衡，使用Parrinello -Rahman Barostat74在1 Bar上保持压力，为100 ps。NPT集合中的生产模拟为50 ns的每个持续时间，在310 K的温度下。用粒子网埃瓦尔德方法75处理远距离静电，其中这些真实空间的长距离切口值和范德华力的真实空间长距离截止值将设置为10Å。使用LINCS算法76,77限制了含有氢原子的共价键，允许2 FS积分步骤。 　　通过EPR光谱分析了H​​UC的铁硫簇的组成。X波段EPR测量在配备了Superx EPR049微波桥和圆柱形TE011 ER 4122SHQE腔内的Bruker Elexys E500光谱仪上进行，与牛津仪器连续流冷冻剂有关。使用ITC 503温度控制器（Oxford Instruments）的液态氦流实现了测量温度。在1 atm H2下孵育后在整洁的氩气气氛或闪光冻干的情况下制备了在空气中分离的HUC样品，并在温度范围40-7 K的温度范围内收集X频段EPR光谱，并在不同的微波炉下。使用Easyspin v.6.0.0.0-DEV47（参考文献78），对EPR光谱中的NI信号进行了初步模拟。 　　在含有50 mM Tris的缓冲液中，在ATR晶体表面沉积了4 µl体积的5 mg ML -1 HUC酶溶液。该样品在实验室气氛（空气）下应用，在100％氮气下干燥，并用加湿的气溶胶（100 mM Tris-HCl（pH 8））补充水分，如前所述79,80。一个定制的PEEK电池（灵感来自Stripp等人的启发），该单元允许安装在FTIR光谱仪中（vertex v70v，bruker）中的ATR单元（来自Harrick的Bioradii）。记录了光谱，以2 cm -1的分辨率，80 Hz扫描仪速度记录，并在不同数量的扫描（至少100次扫描）上平均。所有实验均在环境条件（室温和压力，水合酶膜）下进行。使用Opus 8和Origin 2021软件分析数据。为了评估HUC [Nife]簇对环境空气，N2和H2的响应，PEEK细胞按以下序列依次冲洗了PEEK细胞：N2（环境空气隔离酶），2H2，N2，H2，H2，环境空气。在收集每种气体中的光谱之前，允许HUC光谱的变化稳定。 　　在厌氧条件下进行蛋白质膜电化学实验。3电极系统由（1）AG/AGCL（4 m kCl）作为参考电极组成，（2）5 mm直径的热解石墨边缘（PGE）在环氧树脂中作为旋转磁盘工作电极，（3）石墨杆作为反电极。玻璃电池采用用于温度控制的水夹克和H2流量的气体入口/出口。所使用的缓冲液由5 mm 2- [N'-甲烷] - 乙烷磺酸（MES），5 mm 2- [N'-循环己基氨基]乙烷磺酸（CHES），5 mm N' - [2-羟基乙基] piperazine-N'-2-2-乙烷硫酸（Hydroxythyl）硫酸乙烷酸（Hydroxythyl）（Hydroxy）N'-Tris [羟甲基]甲基-3-氨基丙烷磺酸磺酸（TAPS），5 mM乙酸钠，带有0.1 M Na2SO4为携带电解质，在20°C下用H2SO4滴至pH 7.0，并用N2净化3至4小时。为了去除PGE电极中的残留O2，以100 mV s -1从0到-800 mV（与SHE，标准氢电极）以10扫描。为了将HUC粘附到脱氧的PGE电极上，将表面用P1200砂纸磨损，并用纯净的水冲洗。在含有50 mM Tris，150 mM NaCl pH 8的缓冲液中的5 mg ML -1 HUC酶溶液与多粘蛋白B硫酸盐混合，并转移到电极表面。然后将细胞溶液用H2（1 Bar，10分钟）饱和，然后在系统的循环伏安图中使用固定的酶记录在10 mV s -1处。记录了空白电极的环状伏安图，没有固定酶。使用PGSTAT10和GPES 4.9软件（MetroHM/Autolab）获取电化学数据。使用Origin 8软件分析数据。所有潜在的价值都与她相比。实验是在两种独立的HUC膜上进行的，每部胶片至少扫描了两次。 　　蛋白质膜电化学实验是在充满N2填充的厌氧手套箱（杂物盒技术有限公司，O2 <2 ppm）中进行的。使用带有气体入口和出口阀的玻璃电化学电池进行实验。主电池室被水夹克包围，以控制温度。所有实验均在25°C下进行。将饱和的曲霉电极（SCE）用作参考，并将其固定在包含0.10 M NaCl的隔离玻璃臂中，并通过Luggin毛细管连接到主细胞室。与在25°C相比，用二甲醇为+244 mV校准了SCE，并且在所有数字中，电势都可以校正为V与她与她相比。工作电极是PGE旋转磁盘电极，直径为2 mm，并用碳化硅纸（首先P1200，然后是P4000）抛光。电极旋转由MetroHM Autolab Ime663旋转器控制，并在此处显示的所有实验中以2,000 rpm旋转电极，以实现有效的质量运输，以实现往返于固定的酶膜的有效质量运输。使用铂金属电线作为计数器电极。循环伏安法由使用NOVA软件1.10的Autolab PGSTAT 10 PotentioStat控制。所有实验均通过气体冲洗通过电化学电池的顶空进行。使用气体质量流控制器（Smart-Trak2，Sierra Instruments）从N2中的纯AR，纯H2和5％H2的圆柱体中制备气体混合物，以获得H2中所需的H2的部分压力（AR AR或N2）。在所有实验中使用混合缓冲系统。它由MES，HEPES，TAPS，CHE（全部来自Melford）和乙酸钠（Sigma）中的每个MES组成15毫米，并以0.1 M NaCl（Fisher）为支撑电解质。使用纯净水（Millipore：电阻率18.2MΩcm）制备所有溶液 并在25°C下用HCl滴定为pH 7.0。将缓冲区用N2冲洗过夜，以将O2拆除，然后将其带入杂物盒。为了制备HUC膜，将2 µL酶溶液（含有20 mg Ml -1多氧化物B硫酸盐作为共adsorbate）被发现在新鲜抛光的PGE电极表面上，并剩下3分钟；然后将电极用纯净的水冲洗，以去除未吸收的酶。将电极放置在包含8 ml原始混合缓冲液的电化学电池中。为了在测量过程中最大程度地减少蛋白质膜的损失，将0.025 mg ML -1多粘蛋白B硫酸盐添加到混合缓冲液中。在施加电势之前，将细胞顶空间用气体冲洗至少15分钟，以与细胞溶液完全平衡。记录循环伏安图在1 bar处的恒定气流通过恒定的气流。如先前所述83,84。这些氢酶在室温下首先在100％H2以下激活至少5小时。HYD1和HYD2的膜与HUC一样制备，但不使用硫酸多粘蛋白B。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。