从头设计的蛋白质中和致命的蛇毒毒素

　　使用家族从Uniprot网站收集细胞毒素的氨基酸序列：“蛇三指毒素家族短链亚科IA型IA细胞毒素亚菌群”作为查询。在Clustal Omega62中，将最终的86个独特的CTX序列进行多个序列比对。使用这些比对，设计了一个共识序列，以代表整个对齐序列的每个位置最常见的氨基酸。在此过程中，分析了序列比对的每一列以选择最频繁的氨基酸。在没有单个氨基酸占主导地位的情况下，使用共识符号来代表一组类似的氨基酸，例如其特性，例如电荷或疏水性。这种方法允许表示保守的生化特性，而不是具有较高可变性的位置的特定氨基酸身份。 　　为了使用rfDiffusion产生所需的粘合剂 - 靶标β链配对相互作用，折叠调节张量描述了与基质格式相互作用的单个粘合剂β链与靶β链相互作用的折叠张量，以推理以rfdiffusion。通过两个张量提供了此信息：An [L，4]次级单热张量（0 =α-螺旋，1 =β链，2 = loop and 3 =屏蔽的二级结构身份），以指示Binder-Target-Target-target-target-targent-tarment-the Invient（L，3]邻接的二级残留物的二级结构分类（0 = 1 = nont = nont = nort）2 =掩盖的邻接），以指示粘合剂 - 靶标复合物中每个残基的相互作用伴侣残基。对于此处描述的粘合剂的设计，二级结构张量表示完全掩盖的粘合剂结构，除了设置为β链身份的粘合剂残基，而邻接张量表示粘合剂 - 靶标残基之间的掩盖邻接，除了预先定义的绞线残基是固定的固定性固定的固定性固定的固定性。 　　SCNTX（PDB 7Z14）和α-曲霉毒素（PDB 1YI5）的晶体结构是RFDiffusion的输入。在共识细胞毒素的情况下，使用了AF2模型。使用二级结构和RfDiffusion模型中的二级结构和嵌段张量，为每个目标生成了大约2,000个扩散的设计。所得的骨干库使用蛋白质MPNN进行了序列设计，其次是Fastrelax和AF2+初始猜测。根据AF2预测对齐误差（PAE）过滤所得的库。 < 10, predicted local distance difference test (pLDDT) >80和Rosetta Delta Delta G（DDG） < −40. 　　The AF2 models of the highest-affinity designs for each toxin target were used as the inputs for partial diffusion. The models were subjected to 10 and 20 noising time steps out of a total of 50 time steps in the noising schedule and subsequently denoised (“diffuser.partial_T” input values of 10 and 20). Approximately 2,000 partially diffused designs were generated for each target. The resulting library of backbones was sequence designed using ProteinMPNN after Rosetta FastRelax, followed by AF2 + initial guess38. The resulting libraries were filtered on the basis of AF2 PAE < 10, pLDDT >80和Rosetta DDG <-40。 　　SCNTX是从甲基营养的酵母菌（komagataella phaffii）（以前称为pichia pastoris）中重组表达的。将SCNTX序列用于酵母中的密码子优化，并包括N端His6标签，其次是生物素受体肽和烟草eTCH病毒蛋白水解位点。如前所述进行表达30。将培养基透析透析过夜（50 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）和20 mM咪唑）。使用NGC色谱系统（Bio-RAD）进行纯化，并具有5​​ mL固定的金属亲和色谱（IMAC）镍柱（Bio-Rad）。加载后，用5列的洗涤缓冲液洗涤色谱柱，以去除非特异性结合的蛋白质。然后使用在10列体积上的250 mM咪唑梯度洗脱蛋白质。在280 nm处具有高吸光度的分数合并，并针对50 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）透析。在SDS -PAGE上评估了纯度以确认大小。将蛋白质溶液等分并储存在-20°C以供进一步使用。 　　α-曲霉毒素（L8114）是从Latoxan获得的。来自N. pallida的细胞毒素来自Sigma-Aldrich（217503）。 　　从Amerigo Scientific以冻干形式获得了从N. nigricollis（CV01089563VEN）和N. pallida（CV01089566VEN）初始中和筛查的整个毒液。括号中提供了目录编号。 　　对于人角质形成细胞中的体外中和实验，来自N. nigricollis（L1327）的整个毒液，Naja Nigricincta（L1368），Naja Mossambica（L1376），Naja Nubiae（L1342）（L1342），Naja Katiensis（L1375）从拉托斯（Latoxan）以冻干形式购买了帕利达（N. Pallida）（L1321）。括号中提供了目录编号。 　　对于体内抗周期毒素研究，N。Nigricollis毒液来自利物浦热带医学学院的野生型坦桑尼亚标本。 　　设计了设计的蛋白质序列，以在大肠杆菌中表达。线性DNA片段（Eblocks;集成的DNA技术）编码的设计序列包含适合克隆到PetCon3载体中的悬垂式酵母显示（Addgene＃45121）和LM627载体的悬垂，用于蛋白质表达（Addgene＃191551），通过金门克隆。 　　对于酵母转化，将50-60 ng的PETCON3用NDEI和XHOI限制酶消化，并根据先前的研究中所述的方案，将100 ng的插入物（Eblocks）转化为酿酒酵母EBY100。在具有2％（w/v）葡萄糖的C-TRP-ura培养基中培养EBY100培养物。为了诱导表达，将最初在C-TRP-ura培养基中生长的酵母细胞以2％（w/v）的葡萄糖转移到含有0.2％（w/v）葡萄糖的SGCAA培养基中，并在30°C诱导16-24 h。诱导后，将细胞用PBSF（磷酸盐缓冲盐水（PBS）用1％（w/v）牛血清白蛋白）洗涤，并在室温下使用无避免性标记条件在室温下用生物素化的毒素靶标将40分钟标记为40分钟。63。随后，将细胞洗涤，重悬于PBSF中，并根据每种独特设计单独分类，并在Attune NXT NXT NXT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）中使用96孔兼容的自动采样器进行分类。 　　在补充卡纳霉素的50 mL研究器自诱导培养基中进行蛋白质表达，并在37°C下过夜培养。通过以4,000×g离心10分钟收集细胞，并重悬于裂解缓冲液（100 mM Tris-HCl，200 mM NaCl和50 mM Imidazole）中，并补充了Pierce蛋白酶抑制剂片剂（无EDTA）。通过使用QSONICA Q500仪器进行超声处理，具有四管齐的号角2.5分钟，总幅度为80％，可以实现细胞裂解。通过以14,000×g离心40分钟来阐明可溶性部分，然后在真空歧管上使用Ni-NTA树脂（Qiagen）通过亲和色谱法纯化。使用低盐缓冲液（20毫米Tris-HCl，200 mM NaCl和50 mM咪唑）和高盐缓冲液（20 mM Tris-HCl，1,000 mM NaCl和50 mM Imidazole）进行洗涤，然后用电气洗脱，并用耗尽的缓冲液（20毫米Tris-Hcl，200 mm Nacl，200 mm Nacl和500 mm imIdazole）。使用SEC运行缓冲液（20 mM TRIS-HCL和100 mM NaCl（pH 8），在室温下，将洗脱的蛋白质样品在室温下在SuperDex S75上注射到配备自动采样器的äkta纯系统中。合并单分散峰分数，使用自旋过滤器（3 kDa分子量截止； Amicon； Millipore Sigma）浓缩，并在下游表征之前存储在4°C下。通过使用纳米体分光光度计（Thermo Fisher Scientific）在280 nm处测量吸光度，并使用Protparam工具从其氨基酸序列获得的灭绝系数来确定蛋白质浓度。 　　BLI实验是在带有链霉亲和素涂层的尖端的Octet Red96（Fortebio）仪器上进行的（Sartorius项目编号18-5019）。缓冲液包括1×HBS-EP+缓冲液（Cytiva BR100669），补充了0.1％W/V牛血清白蛋白。使用前，将尖端预孵育至少10分钟。然后将尖端顺序孵育在生物素化的毒素靶标，缓冲液，设计的粘合剂和缓冲液中。 　　使用BIACORE 8K仪器（Cytiva）进行SPR实验，并使用随附的评估软件进行分析。将生物素化的α-曲霉毒素固定在链霉亲和素传感器芯片上（Cytiva）上。对于SCNTX和Pallida细胞毒素，固定化涉及通过与N-羟基糖糖酰亚胺的反应在脱氧片上的芯片上激活羧甲基。然后通过酰胺链接将配体共价键入芯片表面，并用乙醇胺（https://doi.org/10.1007/978-1-5978-1-59745-523-7_20）用乙醇胺（https://doi.org/10.1007/10.1007/100.1007/10.1007/10.100.100）阻塞。在1×HBS-EP+缓冲液（Cytiva BR100669）中，将浓度增加的蛋白质粘合剂飞行。 　　通过CD在JASCO J-1500 CD光谱仪中评估了二级结构含量，该光谱仪与Peltier System（EXOS）耦合以进行温度控制。实验是在石英细胞上进行的，其光学路径为0.1 cm，覆盖200–260 nm的波长范围。据报道CD信号为摩尔椭圆度（θ）。热折叠实验之后，随温度的函数在222 nm处的椭圆度信号发生变化。通过从20到95°C的1°C min -1加热来使蛋白质变性。 　　使用坐式滴蒸气扩散法进行了粘合剂络合物的结晶实验。使用SPT LabTech的蚊子LCP的96孔格式在200 NL液滴中进行了结晶试验。使用Jansi的UVEX Crystal Plate Hotel System对水晶滴进行成像。液化天然气粘合剂络合物的衍射质量晶体在硫酸铵1.5 m和2周内出现25％（v/v）甘油。SHRT粘合剂的衍射质量晶体出现在0.08 m乙酸钠三水合物（pH 4.6），1.6 m硫酸铵和20％（v/v）甘油中。对于CYTX_B10复合衍射，质量晶体出现在0.1 m 2-（N-甲磷脂）乙磺酸（MES）（MES）（pH 6），0.01 M氯化锌，20％（w/v）聚乙烯糖（PEG）6000和10％（V/V/V）乙烯乙烯乙二醇。将晶体冷却在液氮中，然后转运到同步加速器进行衍射实验。 　　衍射数据是在国家同步子源II梁线AMX（17-ID-1）上收集的。使用XDS64评估和集成了X射线强度和数据降低，并在CCP4I2 Program Suite Suite65中使用毫无意义/无目的的合并/缩放。该结构是使用使用Phaser66设计的模型来确定的。分子置换后，使用phenix67改进并完善了模型。使用COOT68在精炼周期之间进行模型构建。使用Molprobity69评估了最终模型。数据收集和完善统计数据在扩展数据表1中报告。最终的原子坐标，MMCIF和结构因子分别存放在PDB中，分别使用登录代码9BK5、9BK6和9BK7沉积。 　　内源表达肌肉型NACHR的人类衍生的横纹肌肉瘤RD细胞（美国型培养物收容）用于电生理实验20。按照先前的研究20中详细介绍的协议，在Qube自动电生理学平台（Sophion Bioscience）上进行了平面全细胞贴片钳记录（Sophion Bioscience）（Sophion Bioscience）。将蛋白质结合剂与大约80％的抑制浓度（IC80）在各种毒素与诱因的摩尔比（1：1：1：1：1：1：3、1：9和1:27）处预孵育，然后添加到细胞中。将毒素抑制乙酰胆碱（ACH; 70 µM）在存在或不存在粘合剂的情况下的能力归一化为完整的ACH反应，并在每组中平均（n = 16）平均（n = 16），并以非肿瘤浓度 - 反应 - 反应图表示。我们使用Sophion Analyzer v.6.6.70（Sophion Bioscience）和GraphPad Prism v.10.1.1（GraphPad软件）分析了数据。 　　HEK293T细胞在Dulbecco的改良鹰培养基（Gibco）中培养，并在37°C和5％CO2下补充了10％胎牛血清。在不存在或存在1：1或5：1摩尔比的情况下，将细胞从pallida（34 µg mL -1）和N. nigricollis（42 µg mL -1）中进行商业整体毒液。平行运行缓冲液和仅粘合剂对照，并在室温下预孵育30分钟，然后再添加HEK293T细胞。为了确定可行细胞的百分比，根据制造商的协议进行实时GLO MT细胞生存力测定法（Promega）。一式三份进行实验，结果表示为平均值±S.D。 　　如先前所述，培养了N/TERT降低的角质形成细胞70。在确定了七个Afronaja蛇的IC50之后，在不存在或存在1：5摩尔比毒液比率的情况下，N/TERT细胞的IC50的两倍。平行运行缓冲液和仅粘合剂对照，并在添加N/TERT细胞之前对所有样品进行预孵育（37°C 30分钟）。为了确定可行细胞的百分比，根据制造商的方案进行了CellTiter-GLO发光细胞活力测定（Promega）。一式三份进行实验，结果表示为平均值±S.D。 　　所有测定都使用雄性非瑞典白化小鼠（20–30 g），并调整所有剂量。测定的毒素为α-曲霉毒素（7,820 Da，来自摘自拉特托克斯S.A.S. N. Kaouthia毒液）和短链神经毒素SCNTX（8,944 DA，重新表达）。将毒素以1.0 mg mL -1的含量溶解在PBS中，然后根据需要在PBS中稀释。对于毒素LD50的测定，使用了每剂三只小鼠的五剂，并在右下腹部区域内注射100 µL推注。控件仅收到PBS。在前2小时观察注射的小鼠，然后在24小时再次观察到。使用Quest Graph LD50计算器71计算LD50值。 　　在预孵育实验中，将三个LD50值（α-粘毒素，0.294 µg g-1小鼠； SCNTX，0.261 µg G-1小鼠）与PBS中的超过10倍摩尔在PBS中混合，并在PBS中与其各自的蛋白质结合剂，并在房间温度下进行30分钟的固定在腹膜之前。将五只小鼠组注入粘合剂：毒素混合物，并在2和24小时观察到。在救援实验中，在相应的粘合剂前15或30分钟腹膜内给予毒素（三个LD50值），在10倍或五倍的摩尔过量腹膜内给予五只小鼠组。对杀伤力的保护是在24小时时的％死亡率测量的。 　　CD1雄性小鼠（18-20 g; Charles River Laboratories）在未经特定的无病原体条件下进行实验之前，将其适应1周。保持房间的条件为23°C，湿度为45–65％，灯周期为12/12 h（350 lux）。将小鼠放在含有120 g木木木纤维床上用品（JRS）的Tecniplast GM500笼子（501 cm2的底面积）中，以及Z-Nest可生物降解的基于嵌套和环境富集的材料（Red House，Red House，透明的聚碳酸酯隧道和Loft）。这些小鼠随意进入自动供水系统中的辐照的Picolab食品（Labdiet）和反渗透水。到达后，将动物分成笼子（实验单位），并且未进行进一步的随机分组。 　　在接受100μl体积的腹侧腹部区域（后侧侧面区域）接受皮内注射之前，将所有小鼠用5 mg kg -1吗啡（皮下注射）预处理（皮下注射）。仅毒液对照组组成的五只小鼠接受了63μgnigricollis（坦桑尼亚）毒液（溶解在PBS中）。对于保护测定，将粗毒液预孵育（37°C时30分钟），细胞毒素的变化：粘合剂比为1：1，1：1：1：1：2.5和1：5（n = 3）（n = 3）（根据毒液中细胞毒素的比例估算比率）。在此之前，对照组（n = 3）仅注射了单独的细胞毒素粘合剂（278 µm，相当于1：5细胞毒素：粘合剂剂量），以检查细胞毒素粘合剂的耐受性。对于样本量，n = 3用于接受细胞毒素粘合剂的组，因为这是一个试验实验。n = 5由于病变大小的变化而用于毒液对照组，这是世界卫生组织推荐的大小。总共使用了17只小鼠。在实验过程中未使用包含或排除标准，并且在分析中使用了所有数据点。没有使用策略来控制混杂因素。所有实验者在实验和分析过程中都知道小组分配。 　　72小时后，将小鼠对二氧化碳浓度升高，并切除病变。测得的结果是病变的大小。切除后立即使用数码相机拍摄病变的照片，并使用毒液诱导的皮肤分析分析工具（VIDAL）72确定皮肤分数病变的严重程度和大小。 　　根据政府原理，美国公共卫生政策，美国农业动物福利行动和指南和使用该指南，在北科罗拉多大学进行了体内神经毒性测定的动物实验，并在北科罗拉多大学进行了2303D-SM-S-26。 　　利物浦热带医学学院和利物浦大学的动物福利和伦理审查委员会批准了体内皮肤分裂测定的动物实验，并根据英国家庭办公室项目许可证P58464F90根据英国动物（科学程序）法（1986年）进行。 　　HEK293T细胞（American Type Curetion Comman CRL-3216）和N/TERT免疫化角质形成细胞，由E. O'Toole（伦敦皇后大学）提供，通过形态评估进行了验证，并经过测试并针对霉菌性污染进行了测试。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。