RNA靶向释放CRISPR – CAS12A2的不加选择的核酸酶活性

　　菌株，质粒，引物和核酸底物可以在补充表1中找到。本文中使用的突变体构建体是使用Q5位置定向的诱变试剂盒（NEB）通过指向的诱变来制备的。设计了引物，并使用Nebase Changer工具确定退火温度。所有引物都是通过IDT订购的。用KLD酶混合（NEB）实现质粒连接，并测序完成的质粒以验证正确的改变（质粒）。 　　N末端六边形标记的CAS12A2，各种突变质粒转化为化学胜任的大肠杆菌NICO21细胞（NEB）。在37°C下生长的20 ml lb培养基中，选择了一个来自转化的单个菌落，以在夜间生长的20 ml lb培养基（16-18 h）。每个起动器培养物用于接种1.0升TB培养基，然后在37°C下在600 nm的0.6处长大至600 nm的光密度。将培养物在冰中冷却15分钟，然后再在18°C生长16-18小时，然后通过离心收集。将细胞颗粒储存在-80°C或立即用于蛋白质纯化。 　　将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（25 mM Tris pH 7.2，500 mM NaCl，2 mM MGCL2，10 mM咪唑，10％甘油，10％甘油）中，并用蛋白酶抑制剂（2μgml -1 rototinin，10μmLeupeptin，10μmLeupeptin，0.2 mm aebs and 1.2 mm aebsf，1.0 pep，1.0 pep，1.0 pep，1.0 mm a1 mg ml -1溶菌酶，并在冰上孵化30分钟。通过超声处理裂解细胞，并通过离心阐明。澄清的裂解液在4°C下批处理至镍树脂30分钟，然后允许流过。然后，裂解液再次通过两次镍树脂。用镍洗涤缓冲液（25毫米Tris pH 7.2、2 m NaCl，2 mm MGCL2、10 mM咪唑，10％甘油）洗涤镍树脂，并用镍洗脱缓冲液（25 mm Tris pH 7.2，500 mm NaCl，2 mm NaCl，2 mm MgCl2，250 mmmgcl2，250 mmmmmmmmmmmmmmmi imi imi imI cercerol，10％glycerol，10％glycerol，10％glycerol，10％glycerol，10％glycerol）。使用HIPREP 26/10脱盐柱（Cytiva）或PD10 Sephadex G25M柱（cytiva）（Cytiva）（Cytiva）（Cytiva）（Cytiva）（Cytiva）（Cytiva），根据纯化的尺寸，将镍的脱盐脱水到低盐缓冲液（25 mm Tris pH 7.2，50 mm NaCl，2 mM MGCL2，10％甘油）。然后，使用低盐缓冲液在离子交换柱（HITRAP SP HP或HITRAP Q HP色谱柱（Cytiva）上加载蛋白质样品，具体取决于构建体的等电点），并用高盐缓冲液梯度洗脱，并用高盐的缓冲液（25 mm Tris pH 7.2，1.2，1.0 m Nacl，2 mm nacl，2 mmmmmmmmmmgcl2，10％glyccerol）。 　　然后将峰值装订汇总并集中到约1.0 mL。在此过程中，通过用低盐缓冲液重新填充浓缩剂两次来换成高盐缓冲液，可以脱盐。使用SEC缓冲液（25 mM HEPES pH 7.2，150 mM NaCl，2 mM MGCL2，5％甘油），将冷冻EM的浓缩蛋白用于Cryo-EM的浓缩蛋白。然后将峰值分数汇总并再次集中。浓蛋白要么在液氮中闪烁，要么用于冷冻EM的复杂形成。 　　在将CRRNA添加到CAS12A2之前，将RNA在65°C下孵育3分钟，然后冷却1°C min -1至室温。通过将蛋白质和合成CRRNA组合为1：1.2摩尔比（25 mM HEPES pH 7.2，150 mM NaCl，2 mM NaCl，2 mM MGCL2，5％甘油）和在24°C孵育10分钟，以二进制复合物在1：1.2摩尔比中形成二元复合物。然后将未结合的CRRNA从超级dex 200 10/300增加GL尺寸柱（Cytiva）上的二进制复合物分离为冷冻EM缓冲液（12.5 mM HEPES pH 7.2，150 mm NaCl，2 mm MMGCL2）。洗脱蛋白在100 kDa MWCO自旋浓度（Corning）中浓缩至30μm，并在液氮中闪烁。 　　在圆形二科（CD）缓冲液（20 mM Tris pH 7.2，100 mM NaCl）中，以0.3-0.5 mg ml -1浓度制备Cas12A2突变体的蛋白质样品。Far-UV CD读数使用JASCO-J1500光谱仪。使用50 nm min -1（2 s响应时间和三个扫描的积累）从260-190 nm获得CD光谱。通过使用15°C H -1的温度坡道，在10–90°C的温度范围内，在10–90°C的温度范围内每1°C监测CD信号，每1°C每1°C监测CD信号，从而获得CAS12A2（ΔPI）样品（ΔPI）样品（ΔPI）样品的熔融曲线。JASCO Spectra Manager软件将CD信号转换为摩尔椭圆度。 　　如前所述进行了质粒固化测定1。简而言之，使用CAS12A2和3×CRISPR重复制备免疫系统质粒，并通过热震动转化转化为BL21 AI细胞。然后将表达免疫系统的细胞进行电解41，并立即通过50 ng的靶标或非目标质粒进行电穿孔转换。在含有1 mM IPTG，0.2％阿拉伯糖和免疫系统质粒的抗生素的450μllb培养基中回收转化18小时。然后将恢复的转化在101和106之间的LB培养基中连续稀释，并在含有1 mM IPTG，0.2％阿拉伯糖和抗生素的LB琼脂平板上发现了10μl滴剂，用于免疫系统和靶标或非靶标质粒。在稀释系列中最高可计数的位置计数菌落，并计算靶标质粒和非目标质粒之间的相对转化效率。 　　与CRRNA的WT CAS12A2或CAS12A2（ΔPI）的二进制复合物与各种靶标（FL，∆PFS，∆5和∆10）与600 nm Cas12a2、720 nm CrRNA和300 nm FAM标准靶的600 nm cas12a2、100×3.1×NEB 3.1 buffer ph的最终反应条件（720 nm CRRNA和300 nm fam fam）靶标合并。MGCL2，100μgml -1 BSA）。二进制复合物首先是通过将WT CAS12A2或CAS12A2（ΔPI）与CRRNA结合为1：1.2摩尔比，并在室温下与NEB 3.1缓冲液作为2×Master混合物一起孵育30分钟。然后将二进制复合物和靶RNA组合到其最终反应浓度中，并在室温下孵育1.0小时，然后与1：1（v/v）苯酚 - 氯仿pH 4.5淬灭4.5。 　　用苯酚 - 氯仿pH 4.5淬灭反应，并通过闪烁混合，然后旋转30 s。反应产物以12％的完全贬低甲醛（FDF）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶的含量为12％，如前所述42所述，并进行了较小的修饰。载荷染料被30％甘油代替，在将电压增加到150 V之前，在50 V下以50 V的凝胶运行。 　　将CAS12A2和CRRNA的二进制复合物与FAM标记的FL靶RNA结合到600 nm Cas12A2、720 nm CRRNA的最终反应条件，在1×NEB 3.1缓冲液中的300 nm靶RNA（50 mm Tris pH 7.9，100 mm Nacl，100 mm Nacl，10 mm mgcl2，100 mm mgcl2，100 mmmgcl2，100°g ml-1 bsa）。二进制复合物首先如激活测定中所述形成。然后将2×主混合物与靶RNA结合，并在37°C下孵育。在时间点5、15、30、60和120分钟处采集样品，并在pH 4.5苯酚 - 氯仿中淬灭。然后如激活测定中所述，在12％FDF -PAGE凝胶上运行样品。将完成的凝胶成像以进行FAM荧光，然后用SYBR金染色，并再次成像以显示未标记的RNA物种。 　　将FAM标记的FL靶RNA（300 nm）与一系列二进制复合浓度（600、300、150、75和37.5 nm）结合使用，以达到2：1、1：1：1：1：1：1：1：2、1：4和1：8的复合/目标比。二进制复合物首先是通过将CAS12A2（1,200 nm）与CRRNA组合为1：1.2摩尔比形成的，并在37°C与NEB 3.1缓冲液作为2×Master混合物中孵育30分钟。然后将二进制复合物在2×NEB 3.1缓冲液（100 mM Tris pH 7.9，200 mM NaCl，20 mM MGCL2，200μgml -1 BSA）中串联稀释，以形成每个复合物/目标比的2×主混合物。将每种2×主混合物与靶RNA结合，并在37°C下孵育1.0小时，然后用苯酚 - 氯仿pH 4.5淬灭。如激活测定中所述可视化淬火样品。 　　含有600 nm CAS12A2（WT或突变体）和720 nm CRRNA的反应与300 nm FL靶RNA和300 nm FAM-LAIM-LABEL的非目标RNA，SSDNA或DSDNA合并。二进制复合物首先如前所述形成为4×主混合物。将主混合物与靶标和非目标底物结合，并在37°C下孵育1.0 h，并用苯酚 - 氯仿pH 4.5淬灭。然后将样品在12％7 M尿素页凝胶上分离，并成像以进行FAM荧光。 　　为了测试靶标与CAS12A2预留的作用，将100 nm CAS12A2-CRRNA复合物在室温下与NEB 3.1缓冲液中的200 nm靶RNA孵育2小时（50 mM Tris-HCl pH 7.9，100 mM NaCl，NaCl，NaCl，10 mm MGCL2，10 mm MGCL2，100μgml-1 bsa）。孵育后，将CAS12A2/CRRNA/靶混合物与1μMRNaseAlert或DNase Alert（IDT）合并，并允许在室温下进行60分钟的反应。将这些反应与与RNase警报或DNase警报同时添加的靶RNA的相同反应条件进行比较。使用协同H4板读取器（Biotek）跟踪荧光信号，并在GraphPad Prism中绘制数据。 　　通过将14 nm CAS12A2（或突变体）与14 nm CRRNA和25 nm靶RNA组合在NEB 3.1缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 7.9，100 mM NaCl，10 mM MGCL2，100μgmgCl2，100μgml-1 BSA）中，制备了质粒裂解反应。在添加7 nm超螺旋PUC19质粒之前，将蛋白质在37°C下预热15分钟。在1、2、5、10、20、30、45和60分钟的时间点采集样品，并在pH 8.0苯酚 - 氯仿中淬火。通过闪烁，然后进行离心，混合淬灭的反应。将样品加载在1％琼脂糖凝胶上，并用溴化乙锭可视化。 　　Flash Frozen Cas12A2二进制复合物迅速解冻。将4 µL二进制复合物应用于C-Flat孔碳栅格（2/2，400网格），在Solarus 950等离子体清洁剂（GATAN）中以4：1的O2/H2的比例在Solarus 950等离子体清洁剂（Gatan）中进行了30 s。将网格用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher）印迹2 s，在4°C下斑点4和100％的湿度，并在液体乙烷中陷入困境。在配备Falcon 4检测器的FEI Glacios冷冻TEM上收集了数据。在Serialem v3.8中收集数据，像素大小为0.94Å，散焦范围为-1.5至-2.5 µm，总暴露时间为15 s，导致总累积剂量为40电子Å2，分为60个电子事件表示。使用CryoSparc Live v4.0.0.0-PrivateBeta.2（参考文献43），在直接进行运动校正，对比度传递函数（CTF）估计和颗粒拾取。总共收集了1,577个视频，其中1,159个视频是根据满足CTF拟合度为5Å或更高的标准的。所有随后的数据处理均在CryoSparc v3.2中进行（参考文献44）。 　　从挑选的987,122个颗粒中，从一轮二维（2D）分类中选择了214,647。将这些颗粒从头开始重建（三个类），然后进行异质细化，导致97,470个颗粒的最终子集，从而产生了3.46-Å分辨率的结构，从不均匀细化。在320像素盒尺寸中重新萃取该子集，将颗粒分成4个曝光组，并进行每组CTF细化和每颗颗粒降压优化，以在非均匀的细化45中实现，从而实现了3.2-Å-Å-outlose Restrountion Reptruction，用于建模。 　　对于三元络合物，将迅速解冻的CAS12A2二进制复合部分补充了四倍过量的热量过量（90°C，持续5分钟5分钟，并迅速冷却至4°C）含PFS RNA的RNA靶标，并在室温（约25°C）（约25°C）中孵育30分钟（约25°C），在Vitrification中进行了较复杂的情况，该方法是在Vitrification中进行的，该方法是在纯化的情况下进行的。使用配备了K3峰顶直接电子检测器（GATAN）的FEI Titan Krios Cryo-Electron显微镜收集数据。用像素大小为0.81Å的Serialem46记录图像。在6-S暴露期间，总累积剂量为70电子Å-2分隔为80帧。总共收集了6,940个显微照片，其中6,614个具有5Å或更高的CTF拟合。如上所述进行了直立处理。 　　总共选择了3,515,037个颗粒，其中2D分类后选择了2,212,319个颗粒。从头重建和异质性改进的多个回合导致了192,639个颗粒的子集，这些颗粒使用上述非均匀的细化重建为2.92-Å分辨率。然后，该地图用于建模。 　　对于第四纪络合物，如上所述制备三元络合物，并在室温下与热磷脂dsDNA双链体一起孵育30分钟。将2.5 µl的复合物施加到C-Flat网格（1.2/1.3，300元）上，并在4°C下在6 s，斑点力0和玻璃化前的湿度100％。如二进制复合物所述，在配备Falcon 4检测器的FEI Glacios冷冻TEM上收集了数据。总共收集了1,755个视频，其中1,539个CTF拟合为5Å或更高，并保留以进行随后的处理。如上所述，进行了直接运动校正，CTF估计和颗粒拾取。 　　总共挑选了1,692,368个颗粒，其中一轮2D分类后保留了425,770个颗粒。一轮从头算重建（3类）随后进行了异质性，产生了260,958个颗粒的子集，这些颗粒被重建为2.97Å，使用不均匀的细化分辨率。从头开始重建和异质改进的其他回合用于进一步对颗粒进行分类，导致最终子集为104,857个颗粒。用384像素盒提取上述颗粒，将颗粒分裂为9个暴露组，并使用不均匀的细化进行重建，并进行每组CTF细化和人均defocus优化，从而导致2.74-Å分辨率的重建，然后用于建模。 　　CAS12A二进制复合物（蛋白质数据库（PDB）5NG6）20刚性体装在CAS12A2二进制复合图中。尽管大多数模型与地图不符，但RUVC和WED域通常是一致的。但是，两种蛋白质的成对爆炸显示了相对插入的多个间隙或插入物。但是，CAS12A RUVC域的单个20个残留发夹很好地拟合了CAS12A2映射，并且在成对爆炸中没有间隙或插入。该片段被分离，并将刚性的身体安装到CAS12A2图中，并使用COOT v1.0（参考文献47）将序列突变为Cas12A2的相应区域。然后，这被用作基于库特中使用的复杂de从头构建其余部分的信托。尝试使用AlphaFold2（AF2）48生成片段以适合地图的尝试是不成功的，因为WED中的相邻残基和RUVC结构域通过蛋白质序列分离，并且REC1和REC2结构域边界与序列单独并不明显。但是，AF2用于验证事后小型结构结构域的建模，该结构结构域是事后的，为此，使用AF2折叠模型的较小，紧凑的区域，并将其拟合到地图中，表明正确的建模。当从头模型由于局部灵活性而含有差距时，这一点特别有用。 　　5'CRRNA手柄是使用CAS12A 5'CRRNA作为模板（PDB 5NG6）构建的。在二进制复合物中，将七核苷酸3'种子区域从头开始建模为Polyu，因为不可能明确确定核苷酸的身份。 　　一旦完全建模，就使用Isolde V1.4（参考文献49）来改善模型对地图的拟合度，并在Phenix V1.19（参考文献50）中实现了实现的真实空间改进，以优化模型几何形状。 　　对于CAS12A2三元络合物，RUVC，WED和部分插入域与二进制复合物中的构象相同。这些是安装在三元复合物图中的刚体。REC1，REC2和插入结构域的C端一半被分别拟合为刚体中的刚体中。使用AF2预测PI结构域的结构，然后手动连接到模型的其余部分。将CRRNA-target RNA双链体建模为COOT内的理想A形式RNA，并手动连接到5'CRRNA手柄。靶RNA 3'PFS从头开始建模。COOT用于拟合模型内的间隙，然后使用Isolde在实际空间改进之前改善模型的质量，如上所述。 　　对于第四纪络合物，将三元络合物结构固定在地图中，然后使用Isolde灵活拟合。使用AF2预测ZR结构域的结构，并手动连接到模型的其余部分。dsDNA双链体是从头开始建模的，一根链以polyt建模，另一个链为polya建模，因为不可能明确确定核苷酸的身份。使用锐化的地图手动对MG2+和Zn2+离子和激活H2O进行建模。如上所述，进行了Isolde和真实空间改进。 　　除了使用pymol v2.5中生成的模量外，所有结构图和视频均使用Chimerax V1.0（参考文献51,52）生成。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。