肝星状细胞通过R-Spondin 3控制肝分散，大小和功能

　　如补充表10所示，从不同来源获得了用于单核测序的人肝组织。根据IRB批准的匹兹堡大学（IRB规程19120198）根据IRB批准的方案收集了肝样品，约翰斯·霍普金斯大学医学学院（IRB方案; IRB方案;KielUniversität，D425/07，A111/99）或从器官采购组织LiseNet Health获得（根据《解剖学礼物法》运营）。所有患者均提供了书面知情同意。在接受肝移植的患者中，从肝脏外植体获得了酒精性肝炎，酒精相关的肝硬化和与MASLD相关的肝硬化的肝脏样品。在术中术中，术中均在术中获得了来自活体供体的所有其他肝样本，这些患者是根据临床术中术中肝活检，例如在预定的肝切除期间，在大型肿瘤学手术期间排除肝脏恶性肿瘤或在药学期间肝组织学评估。在所有情况下，将样品立即在液氮中冷冻，以确保体内时间少于40 s。在所有组中都排除了病毒肝炎或血染色性疾病证据的患者，每天饮酒> 20 g（对于女性）和每天> 30 g（男性）的患者被排除在正常和MASLD组中。由H＆E，Sirius Red和/或Trichrome染色的肝脏部分由董事会认证的病理学家审查。 　　所有动物程序均在哥伦比亚大学机构动物护理委员会（协议，AC-AABQ5565，AC-AABQ55566），当地机构或范德比尔特大学机构动物护理委员会（协议M2000054-01）和指南供指导和使用实验室动物的指南；或在德国政府动物护理和使用委员会的批准下（根据德国国家动物福利指南以及根据许可证号G-251/20的区域委员会法规的规定）。如报告摘要中所述进行的随机化和盲。小鼠被安置在哥伦比亚大学的欧文癌症研究中心和德国癌症研究中心（DKFZ）海德堡的中央动物设施中。他们以标准的小鼠饮食（自随意的水和食物获取）为21–24°C，湿度为45–65％，在12 h – 12 h – 12 h的光周期循环下喂食。先前已经描述了LRAT-CRE小鼠4。CLEC4F-CRE小鼠（JAX，033296）。Rspo3-氟小鼠（JAX，027313;该菌株用于与Lrat-Cre或Lyve1-Cre的十字架），PDGFBR-loxed小鼠（JAX，010977），Rosa26-lox-lox-Stop-lox-lox-lox-lox-tdtomato（tdtom）小鼠（TDTOM）小鼠（TDTOM）MICE（TDTOM）MICE（TDTOM）MICE（JAX），jax，jax，ros ros 00779908，007799908，（IDTR）小鼠（JAX，007900），WLS-串联小鼠（JAX，012888），Lyve1-Cre（Jax，012601）和PDGFRB-P2A-Creert2小鼠（JAX，030201）从杰克逊实验室获得。CDH5-CREERT2小鼠以及MX1-CRE小鼠，COL1A1-氟小鼠，HGF-悬浮小鼠和TGFBR1-粘合的小鼠63已经描述了之前。先前已经描述了RSPO3-氯胞菌小鼠（该菌株用于与PDGFRB-P2A-CREERT2小鼠或CDH5-Creert2的杂交）。绝地小鼠先前已经描述了19。除WLS-串联小鼠外，所有小鼠菌株都 用C57BL/6J小鼠反向交叉超过五次。雄性小鼠在7至42周龄之间使用，除了少数包括雌性小鼠的实验外，每个图中详细介绍了雌性小鼠。为了诱导RSPO3的HSC和EC特异性缺失，用2 mg的他莫昔芬治疗小鼠，通过口服块在100μl玉米油中溶于100μl玉米油中，连续5天在8-12周龄的时候连续5天。在实验使用之前，将小鼠保留为1周的清洗期。为了删除肝细胞中的RSPO3，RSPO3-氟小鼠用AAV8-TBG-CRE（Addgene，107787-AAV8）或AAV8-TBG-NULL（ADDGENE，ADDGENE，ADDGENE，1055536-AAV8）稀释的溶液静脉内用1011个基因组副本施用。对于肝脏中Col1a1的缺失，接收到Polyi：C（GE Healthcare，ww27-432-01，ww27-432-01，intaperitoneal，10μgG – 1），每3天每3天接受MX1-Crenegcol1a1-氟1a1-氟1a1-氟1a1-creposcol1a1-co-creposcol1a1-co-loxed小鼠。模型之间的动物实验样本量有所不同，并且基于对特定模型变异性的估计。 　　为了耗尽HSC，将LRAT-CRE+TDTOM+DTR+小鼠或LRAT-CRE+TDTOM+DTR-同变型注入0.25-2.0 ng kg-1 kg-1二脑毒素（DT; Sigma-Aldrich，d0564，d0564，d0564），否则否则用于实验7天，并在7天中使用了7天。对于某些实验，使用了以前描述的Jedi模型耗尽的HSC的小鼠的肝脏进行分析。对于乙醇诱导的肝损伤模型，用Lieber-Decarli '82含有乙醇和对照饮食治疗小鼠（Bio Serv，F1258，F1259）。乙醇饮食逐渐在5天内逐渐引入，最终浓度为5％，并根据制造商的规程在指定的持续时间内维持。为了模拟代谢功能障碍相关的脂肪肝损伤，给小鼠喂食CDAA-HFD饮食（研究饮食，A06071302）6周。为了诱导与MASLD相关的肝癌，将小鼠喂食CDAA-HFD 24周。在我们的IRB方案中，肿瘤的尺寸极限不超过20 mM的尺寸极限。为了模拟有毒肝损伤，用CCL4或APAP处理小鼠。将Ccl4（Sigma-Aldrich，319961）以3：1的比例溶解在玉米油中，并以0.5 ml kg-1的腹膜内注射，或以1.6 g kg-1的饲料给出。为了诱导严重的肝纤维化，将CCL4溶解在玉米油（400 µg µl -1）中，并以1.6 g kg -1体重的浓度通过口服烤肉递送。每周两次治疗长达20周的小鼠。将APAP（Sigma-Aldrich，A5000）溶解在温暖的0.9％NaCl中，并以300 mg kg-1（solethalthal剂量）过夜饥饿后，将腹膜内注射到小鼠中，以评估肝损伤或以750 mg kg-1（lethal剂量）确定生存。将Allyl醇（Aloh，Sigma-Aldrich，240532）溶解在0.9％NaCl中，并以60 mg kg-1（solethalthal剂量）的腹膜内注射到小鼠中，以评估肝损伤或以75 mg kg-kg-1（lethal剂量）（Lethal剂量）确定生存。诱导肝脏再生， 将小鼠接受70％的PHX或组成型雄激素受体配体治疗，1,4-双（2-（3,5-二氯吡啶氧基）））苯（TCPOBOP）。根据异氟烷和丁丙诺啡麻醉的先前发表的方案65进行70％PHX，除非另有说明，否则将小鼠安乐死48小时。tcpobop（Sigma-Aldrich，T1443）以3 mg kg-1的剂量腹膜内注射，并在48小时后对小鼠安乐死。对于RSPO3救援实验，将HSC耗血或对照小鼠静脉注射为每只鼠标AAV8-CMV-RSPO3（Vector Biolabs，AAV-271188）或AAV-8-CMV-EGFP（Addgene，Addgene，1055530-AAV8）。 　　如先前所述，使用15–30周龄的LSL-TDOM+ C57BL/6小鼠分离出原代小鼠肝细胞，该小鼠已注入了1×1011 GC AAV8-TBG.PI.PI.CRE.RBG（Addgene，107787）7天，7天。Primary hepatocytes were plated and cultured in serum-free William’s E medium (Gibco, 12551-032) supplemented with hepatocyte supplement (Gibco, A13448), 10 µM dexamethasone (Gibco, A13449), 10% FBS, gentamicin and antibiotic–antimycotic (Gibco, 150062) as described以前为14,66。如前所述67，从9-10个月大的雄性BALB/C小鼠中分离出原发性HSC。将HSC播种在12孔板中，并在Dulbecco修饰的Eagle的培养基（DMEM，GIBCO，11965092）中孵育，并补充了10％FBS，庆大霉素和抗生素。4小时后，将培养基更改为含有0.5％FBS的培养基，然后用TGFβ1（2.5 ng ML-1，R＆D Systems，240B），PDGF-BB（20 ng ml-1，R＆D Systems，220BB）或IL-1β（5 ng ml-1 r＆d Systems）处理。24小时后，收集细胞并处理RT – QPCR。对于HSC-羊皮细胞共培养，在肝细胞镀层之前，将HSC直接添加到组织培养物中，以进行接触依赖性的共培养，或以跨性别依赖性的插入（Corning，353180）的形式添加到接触式独立的共培养物中，以在肝细胞：HSC：HSC：HSC：HSC：HSC：HSC：hsc：HSC：hsc：HSC：HSC：HSC：hsc：hsc的。对于某些实验，将中和抗体（Proteogenix，PX-TA1446）或同型对照抗体（Proteogenix，PTX17885）添加到培养基100 nm中。培养24小时后，将EDU添加到培养基中24小时，然后根据制造商的说明（Thermo Fisher Scientific，C10637）进行EDU染色。使用Olympus IX71S1F-3显微镜捕获图像，并使用ImageJ软件进行分析。还收集了在没有EDU的情况下共同培养的细胞进行RT – QPCR分析。人类HSC系LX-268静止一夜之间，并用TGFβ1（2.5 ng ML-1，R＆D Systems，240B），TGFβ2（2.5 ng ml-1，R＆D Systems，302-B2-002），TGFβ33 （2.5 ng ML-1，R＆D系统，8420-B3-005），PDGF-BB（20 ng ML-1，R＆D Systems，220BB）或IL-1β（5 ng ML-1 R＆D Systems，401ML）用于RT – QPCR进行评估。从美国型培养物中获得的小鼠肝细胞系AML12在DMEM（Thermo Fisher Scientific，11965118）中培养，为10％（v/v）抗生素 - 抗生素 - 抗生素 - 抗生素（Gibco，150062）和10％（v/v）胎牛血清（fbs; geminbio; geminbio，deminbio，deminbio，deminbio，deminbio，deminbio，9000108）co。定期筛选细胞系以进行支原体污染。在指定的浓度下，将重组小鼠RSPO3（R＆D 3500-RS）添加到培养基中24-48 h。通过WST-1（Roche，11644807001）确定增殖，并使用RT – QPCR测定Wnt依赖性基因表达。使用类似于上述HSC隔离的方案从小鼠中分离出肝EC，但使用肝脏灌注培养基（Gibco）和肝脏消化培养基（Gibco）补充了20μgml-1 liberase（Roche），在3 mL min-1中使用5分钟，并使用非Paremandamal Cell fraction（MILEC）（MILECAL BI）纯化。130-092-007）和LS列。如上所述，肝脏灌注后的非核细胞细胞分数纯化了库普弗细胞，使用磁小鼠F4/80微粒（Miltenyi Biotec，130-110-443）和LS柱（Miltenyi Biotec）（Miltenyi Biotec）根据制造商的说明。 　　用福尔马林固定肝脏样品，用于石蜡包含的块，或4％的冷冻块中的多聚甲醛。Liver sections were stained with antibodies against Ki-67 (Abcam, ab16667), cyclin D1 (Abcam, ab134175), CYP1A2 (Santa Cruz, sc-53241), CYP2E1 (Abcam, ab28146), RGN (Thermo Fisher Scientific, PA5-56057), GS (Abcam,AB176562），燕麦（Antibodies.com，A15120），CYP2F2（Santa Cruz，SC-374540），HAL（Sigma-Aldrich，HPA038547），E-钙粘蛋白（细胞信号，3195），HNF4α（HNF4α（HNF4α）AB7671）。使用ImageJ分析了KI-67，Cyclin D1，CYP1A2，CYP1A2，CYP2E1，RGN，GS，燕麦，CYP2F2和HAL的正区域。如前所述，在2μm-厚的福尔马林固定石蜡膜膜肝切片上进行多重免疫染色。通过混合675μl蒸馏水，125μl0.5 m Tris-HCl pH 6.8，200μl 10％（w/v）十二烷基硫酸钠和8μL2- ercapto乙醇来制备抗体洗脱缓冲液。使用斐济（V.2.14.0）70，iLastik（V.1.3.3post3）71和CellProfiler（V.4.2.1）72对获得的图像进行处理和分析。使用斐济特异性肝细胞标记的表达使用门户 - 中心静脉轴上的斐济曲线函数进行定量，将轴分为九个相等的扇区。在每个样本的四个代表性领域进行定量。使用相同的程序来确定KI-67染色的肝切片中的区域KI-67+细胞，但使用ImageJ来量化每个扇区内的阳性细胞。根据H＆E图像，使用门户中心轴的上述分裂对九个领域进行了Zonal坏死的评估，然后根据H＆E图像对坏死区（分别为0％，25％，50％，75％和100％）分配了一定比例的坏死区（基于H＆E图像）。为了确定肝纤维化，如先前所述的73，用Picrosirius红色溶液对石蜡肝切片进行染色。在油红O中染色8 µm的冷冻肝切片 （Sigma-Aldrich，O9755）持续10分钟。在蒸馏水中洗涤后，将切片用梅耶尔的血久毒素染色3分钟，并安装在水溶液中。所有图片均在Olympus IX 71S1F-3显微镜上捕获，该显微镜使用QCapture Suite Plus（v.3.1.3.10）耦合到Qimaging Retiga摄像头（v.3.1.3.10），并使用Adobe Photoshop或imagej软件分析图像。对于某些分析，将图像在具有扫描仪控制台（V.102.0.7.5）的Leica SCN400滑动扫描仪上扫描，并使用ImageJ进行量化。 　　通过确定血清ALT和血清AST活性来评估肝损伤。为此，在哥伦比亚大学比较医学研究所或海德堡大学诊所的分析中心测量了样品。根据需要将样品用0.9％NaCl或PBS稀释。对于某些实验，在H＆E肝脏切片中确定坏死区域，并通过ImageJ软件进行量化。 　　使用含有抗蛋白酶（完整的Roche）和抗磷酸酶（Phosstop，Roche）的RIPA缓冲液从肝组织中提取蛋白质。在加入Laemmli缓冲液，在95°C下进行超声处理和沸腾后，将样品加载并在SDS-PAGE凝胶上运行，并使用半干blotting System（Bio-Rad）转移到硝酸纤维素膜（Sigma-Aldrich）上。The following antibodies were used: anti-ALDH2 (Proteintech, 15310-1-AP; 1:10,000), anti-RSPO3 (Proteintech, 17193-1-AP; 1:2,000), anti-GAPDH (Sigma-Aldrich, G9295; 1:75,000), anti-β-actin (Sigma-Aldrich, A3854, 1:10,000), and HRP抗兔（Santa Cruz，SC-2004； 1：2,000）。使用超敏感的化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，34094）在氟化物M系统仪器（ProteEinsimple）上可视化印迹，并使用fiji进行定量。 　　使用Duoset ELISA试剂盒（R＆D Systems）在均质的小鼠肝组织中定量RSPO3蛋白浓度。为此，从同质组织的上清液中收集了来自frozen肝样品的裂解物，然后以1,000g离心20分钟，并调节至100 mg ml-1。还根据制造商的方案，还使用三明治ELISA试剂盒（LSBIO）在培养的原代小鼠肝细胞的上清液中确定RSPO3蛋白。为此，将010万细胞在12孔板中接种，并在12孔板中收集上清液样品，其中补充了10％FCS，1％青霉素 - 链霉素和50 mg ML-1甲状腺霉素，并以1,000克离心20分钟。在Imark微板读取器（Bio-Rad）上阅读ELISA。 　　如前所述14,63进行了淋巴细胞和髓样肝细胞群的流式细胞仪分析。简而言之，将肝组织机械化，然后用1 mg ml -1的胶原酶A（Roche，10103578001）和0.5 µg ml -1 DNase I（Roche，10104159001）在隔离率（RPMI 1640，1％-5％-5％，1％-GB）中进行酶消化。青霉素 - 链霉素和10毫米肝素）在37°C时在150 rpm处持续45分钟。将细胞通过100 µM细胞过滤器过滤，在两部分中洗涤并分离，以分析髓样细胞和淋巴细胞细胞亚群。对于后者，将细胞加载到Percoll梯度上（67％的覆盖层，为40％），然后使用氯化铵 - 钾缓冲液进行红细胞裂解并进行染色。在染色之前，将细胞与幽灵染料红780（Tonbo Biosciences）孵育，以排除死细胞和抗CD16/32（Tonbo，2.4G2，1：200）。包括以下细胞外抗体：抗CD45（BD和Biolegend，30-F11，1：400），抗CD19（Tonbo，1d3，1：200），抗CD3E（Tonbo，145-2C11，1：400）1：400），抗NK1.1（BD，PK136，1：300），抗CD11B（BD，M1/70，1：500），抗CD11C（BD，HL3，1：200），抗F4/80（抗F4/80抗Ly6g（Biolegend，1a8，1：500），抗B220（BD，RA3-6B2，1：200），抗CD44（Biolegend，IM7，1：200），抗CD64，抗CD64（Biolegend，Biolegend，X54-5/7.1，1.200），X5/7.1：200），Anti-CD80（Tony-CD80）（Ton6661，16-10a，16-10a，16-10a，16-10a，16-10a，16-1。（BD，GL1，1：200），抗VSIG4（Ebioscience，NLA14，1：200）和抗MHCII（Tonbo，M5/114.15.2，1：400）。包括以下细胞内抗体：抗CD3E（BD，145-2C11，1：400），抗TCRβ（BD，H57-597，1：300），抗Foxp3（Ebioscience，FJK-16S，1：300），1：300），1：300），抗Ki-67（抗Ki-67）（抗Ki-67）（抗ki-67）（Biolegend，QA16A02，1：200）。使用FOXP3/转录因子染色缓冲液集（TONBO）固定细胞 根据制造商的协议。使用BD LSR Fortessa细胞分析仪分析样品。使用FlowJo（V.10.10.0）进行流式细胞仪分析。 　　如前所述，在肝微粒体中分析了CYP2E1活性，并进行了较小的修饰。为了进行微粒体的制备，将肝组织在50 mM Tris，150 mM KCl，2 mM EDTA缓冲液中均匀，含有Phosstop（Roche，59124500）和完整的Mini（Roche，57350900）。将肝匀浆以6,000克离心5分钟，然后在12,000克的上清液中第二个离心10分钟。将CaCl2添加到上清液中的最终浓度为8 mm，然后以211,000g离心20分钟。去除上清液后，将颗粒重悬于KCl-Tris-EDTA缓冲液中，并再次以211,000克离心20分钟。将颗粒重悬于37°C时在37°C下含有100 mM KPI，pH 7.2，0.2 mm PNP的0.1 mL重悬于510 nm的510 nm处的PRIOSKAN LUX SPECTROPHOOTOMER（TOMELO FISHROPOHOTOME（TOMELO FISHERICIC）分类器。 　　将肝组织在Tristuelyser（Qiagen）中匀浆，并使用氯仿纯化，然后使用RNA分离试剂盒（Qiagen，Roche或Sigma-Aldrich）分离总RNA。使用RNA分离试剂盒直接分离来自细胞的总RNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计进行定量后，使用TAQMAN逆转录试剂（Applied Biosystems，4368813）对RNA进行了反转录。qPCR was run on an Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time PCR system (Applied Biosystems) using PerfeCTa FastMix II buffer (Quantabio, 95120) and the following probes (Thermo Fisher Scientific): 18S (Hs99999901_s1), Acta2 (Mm001546133_m1), Aldh2（MM0047763_M1），ANG（MM00833184_S1），AVPR1A（MM004444092_M1），AXIN2（MM00443610_M1），CCL2（MM00441242_M1），CCL3（MM00441242_M1），CCL3（MM0044441259_G4G4（MM00443111_M1），CCL5（MM01302427_M1），CCND1（MM00432360_M1），CHRNA4（MM00516561_M1），COL1A1，COL1A1，COL1A1（MM008016666_G1），COL166_G111（MM00801666_G1）（MM01289834_M1），CYP1A2（MM00487224_M1），CYP2E1（MM00487224_M1），CYP2F2（MM00484087_M1），EMR1（MM00802530_M1），GLUL（MM00802530_M1）（MM00626646_M1），HAL（MM00456709_M1），HAND2（MM00439247_M1），HSD3B5（MM00657677_MH），IL1A，IL1A（MM00439620_M1），MM00439620_M1），IL1B（IL1B（IL1B（MMMM004342228_MM1），（MM00521920_M1），LOX（MM00495386_M1），MKI67（MM01278617_M1），OAT（MM00497544_M1），PDGFRB（MM00435546_M1），RGN（MM00435546_M1），RGN（RGN（MMMMMM00485711），REA（MM00661105_M1，MM01188251_M1），SLCO1B2（MM00451510_M1），TGFBR1（MM03024015_M1），TIMP1（MM004441818_M1），TNF（MM00441818_M1），TNF（MM00444444443258_MM1）（MM00509695_M1），WNT2（MM00470018_M1，MM00437330_M1），WNT9B（MM00457102_M1）和RSPO3（HS00262176_M1）。 　　使用rnascope多重荧光试剂盒（ACD诊断（ACD），323110）在10 µM LRAT-CRE+ LSL-CRE+ LSL-TDTOM+小鼠中使用RNASCOPE MM-RSPO3 Probe（ACD，402011）（ACD，Opal 520 Recent（ACD），在10 µM冷冻小鼠肝脏中检测到靶RNA（323110）FP1487001KT）。如先前所述，抗RFP（Rockland，600-401-379）用于检测TDTOMATO14。使用安装在TI2显微镜支架上（Nikon Instruments）上的AXR共聚焦扫描仪进行共聚焦显微镜检查，使用×20/0.75 Plan-Apo VC物镜或DLDRC Imaging Core中的Plan-APO VC物镜或×60/1.49 Na apo-Tirf油型物镜。100 plex空间转录组学（100个基因面板在补充表12中显示），重点是Wnt途径，并且在分离平台上进行了分区基因。如前所述，探针设计以及组织切片，加工，探针设计和杂交，幻灯片成像，点分割和数据预处理如前所述29进行。使用Quth Software75使用细胞分割来量化每个细胞的基因计数，进行单细胞空间转录组分析。使用R软件包SEURAT76集成了每个条件的库（IDTRWT，IDTRWT，IDTRHET，RSPO3FL/FL，RSPO3ΔHSC）。分析的细胞包括每个细胞大于或等于10基因计数的细胞。预处理后，使用主成分分析（PCA）和均匀的歧管近似和投影（UMAP）77进行所有100个基因的无偏聚类。基于不同地标基因的表达，在UMAP上鉴定并注释了与不同区域相对应的群集，如先前完成的29。此外，分别基于LRAT和PECAM1的表达在UMAP上鉴定并注释HSC和EC特异性簇。此外，使用Seurat软件包，特征图和小提琴图分别用于可视化基因表达在群集和细胞水平上。最后， 一旦注释簇，将基于基因表达的特定簇的细胞映射到虚拟幻灯片上，以可视化特定簇的空间位置。单个地标基因在周围，区域和周围区域的表达用于验证簇的准确空间定位。对于RSPO3表达的区域和细胞特异性分析，首先使用已建立的地标基因的总体表达来定义区域，然后根据其在这些区域中的定位将细胞分配到三个区域之一。这是通过使用R中的GGPLOT2在一个图像上绘制CYP2F2阳性的细胞，而另一个GGPLOT2图像上CYP2E1阳性的细胞来完成。使用图像处理工具箱在MATLAB中处理这些图像，以平滑并填充区域1或区域3，从而产生两个矩阵描绘区1和区域3区域。如果仅位于区域1区域，则将细胞分为1区，如果仅位于区域3区域，则将区域分类为3区，如果它们位于重叠区和3区区域，则将区域分类为2区。使用Seurat中的VLNPlot函数评估了在区域和簇上评估基因表达水平，包括RSPO3。 　　在高质量的总RNA样品上进行RNA-SEQ分析，RNA完整性> 8（使用Bioanalyzer 2100，Agilent Technologies确定）。哥伦比亚基因组中心处理大量RNA-seq数据。对于每个样本，在Illumina Novaseq 6000系统上对至少有2000万bp的单端读数进行了测序。RTA（Illumina）用于基本调用，而BCL2FASTQ2（V.2.19和V.2.20）用于将BCL转换为FastQ格式，并与衔接机修剪。使用Kallisto（V.0.44.0）创建了转录组（Human，Grch38; Mouse，GrCM38）的Kallisto索引的伪标记。为了探索样本之间的相似性和差异，使用DESEQ2软件包的方差稳定转换函数将计数数据归一化。使用已发布的数据集（GSE68779）进行了CTNNB1ΔHEP和CTNNB1FL/FL肝之间比较的微阵列分析。使用Heatmapper工具78生成热图。使用100个显着性的富集进行HSC缺乏的肝脏中的KEGG途径分析（P< 0.05) genes with the highest combined log-transformed fold change in HSC iDTR- and JEDI-depleted livers compared with their respective controls (GSE211370)79. 　　GSEA was performed using GSEA v.4.3.2 software (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp). Analysis was performed from pre-ranked genes from DESeq2 (v.1.42.0) analysis of bulk RNA-seq data using the GSEAPreranked function with 1,000 permutations on the Hallmark collection from the Molecular Signature Database (MSigDB) or by curating the CTNNB1_Liver gene set from genes with a log-transformed fold change of >1在来自CTNNB1ΔHEP和CTNNB1FL/FL肝脏的微阵列分析中，作为β-catenin调节的肝基因的参考。 　　为了进行SNRNA-SEQ分析，如前所述处理了人和小鼠肝（补充表4和10）。简而言之，在冰上在六孔板的井中用剪刀在1 ml TST缓冲液中用剪刀将冷冻肝组织切碎10分钟。然后通过40μm细胞过滤器将均质溶液通过。使用另外1 mL的TST缓冲液和3 mL 1×ST缓冲液洗涤井并通过40μm的细胞过滤器。在4°C下，在500g的500g下离心5 mL的核悬浮液。将上清液丢弃，然后将沉淀重悬于1毫升的1×ST缓冲液中。然后将核悬浮液通过35μm滤波器。对于单细胞多组ATAC加基因表达分析，使用RNase抑制剂试剂盒（10倍基因组，PN-1000494）分离铬核分离，以分离核与小鼠肝脏分离核。 　　所有分析的SCRNA-SEQ数据，包括从1×CCL4-，2×CCL4-，4×CCL4-和12×CCL4处理的小鼠肝脏（GSE172492）和0、15、30和34周的HF-HFD-HFD-HFD诱导的小鼠（GSE1665504）的34周和34周并以前存放。如前所述，使用10倍铬单细胞平台，使用铬细胞3'图书馆和凝胶珠KIT KIT V.3和铬单细胞B芯片试剂盒（10x Genomics，PN-1000074），使用10x铬单细胞平台（GEMIUM单细胞平台（10x基因组），使用10x铬单细胞平台（10x基因组，PN-1000074），制备了人类SNRNA-SEQ分析的样品（GSE256398）的样品（GSE256398）（PN-1000074），则制备了人类SNRNA-SEQ分析的样本（GSE256398）（GSE256398）（gse256398）将数据与GRCH38参考基因组的修改版本（计数内含子读数以及与外显子保持一致的读数），以及使用细胞Ranger v.3.1.0的估计含细胞分区和相关的唯一分子标识符（UMIS）。 　　总共分析了26个人SNRNA-SEQ数据集和4个小鼠SNRNA-SEQ数据集（补充表10）。如所述，使用Cellbender v.0.2.0中的删除 - 背景函数删除了这些数据集中的环境背景RNA和空液滴（如人类数据集的FPR = 0.01；鼠标数据集的FPR = 0.1）14。对于人类数据集，从Cellbender中输出RAW_FEATURE_BC_MATRIX_FILTERED.H5对于每个样品，将进一步对使用默认参数的SCRUBLET进行DoubleT删除。80。在seurat（v.5.0.1）中分析了来自人类数据集和RAW_FEATURE_BC_MATRIX_FILTERED.H5的RAW_FEATURE_BC_MATRIX_FILTERED.H5的产生单元。 　　对于每个数据集，将样品组合在一起，使用相同标准（Nfeaturerna）过滤低质量的单元格或异常值< 200 or nFeatureRNA >6500或NCOUNT_RNA> 40000或百分比。< 200 or nFeatureRNA >7500或NCOUNT_RNA> 60000或鼠标的百分比> 20）。首先使用标准化，FindVariableFeatures（Nfeatures = 3000），Scaledata和RunPCA函数并行分析每个样品。使用SelectIntegrationFeatures，Find Integrationancner（K.anchor = 10，还原=“ RPCA”）和IntegratedAta函数集成了样品。集成后，使用Scaledata，RunPCA（NPCS = 50），Runumap，FindNeighBors和FindClusters功能在所有单元格上运行了具有批处理校正的集成计数矩阵层的单个集成分析。除非另有说明，否则使用所有默认参数。如先前所述，手动鉴定了包括T细胞/天然杀手，髓样细胞，HSC，ECS，ECS，胆管细胞和肝细胞的主要细胞类型。对于每种主要单元格类型，使用非批化校正的RNA计数矩阵层，使用scaledata，runpca（NPCS = 50），RunuMap，Findneighbors和FindClusers功能重新聚集。如前所述，使用众所周知的标记基因的表达来鉴定详细的细胞类型，每个人群中的标记为小鼠SNRNA-SEQ数据（补充信息4）和人SnRNA-SEQ数据（补充信息5）（补充信息5）中提供了每个人群的标记。鉴定了从两种或多个细胞类型中表达标记基因集的群集，并以双重速度进一步去除。对于每个数据集，使用Seurat v.3中的FindAllmarkers函数鉴定了每个细胞群集中差异表达的基因（DEG）。 　　使用各自出版物中描述的基于Web的工具分析了一些已发布的数据集，包括Henderson Lab82的人类和鼠标SNRNA-SEQ以及LiverCelletlas81的数据集。 　　如上所述识别每个数据集中的细胞类型后，我们在最新的V.5版本中使用了CellphonedB83，以识别N = 6 n = 6个健康肝脏中的配体 - 受体相互作用，我们的人类SNRNA-SEQ数据集（GSE256398）。为了确定小鼠配体 - 受体相互作用，首先使用BiomArt（v.2.60.1）软件包将来自n = 2个健康对照肝的小鼠基因（GSE256398）首先转换为人类基因符号（HGNC），然后通过推荐的程序准备输入文件。使用默认参数和5％的细胞表达阈值进行所有细胞统计分析。通过相互作用得分对细胞 - 细胞相互作用进行排名后，所有与正相互作用评分的相互作用均通过平均表达进一步排名。使用GGPLOT2（v.3.4.4）软件包生成了显示配体 - 受体相互作用，log2转换平均值（分子1，分子2）和log10 [p]值的热图。 　　为了确定MASLD84患者的脂肪植物队列中的生存和肝相关事件，使用rstudio（v.2022.0 build 369）和''warveminer’的rstudio（v.2023.12.0 build 369）中使用r（v.4.3.0），使用rstudio（v.2023.12.0 build 369）中的r（v.4.3.0），使用steatosite数据共享病例的活检子集的每分钟rspo3计数。分别计算出归一化RSPO3计数的最佳切割点，以用于总体存活和肝功能负债（当复合结果的任何组件的第一个编码是在活检日期之后发生的，并使用suff_cutpoint发生死亡，而死亡作为竞争风险），将最大选择的“ MaxStat’套餐”（V.0.7-25的最大选择的级别级别）应用于2.7-25的最大选择。Kaplan–Meier estimator curves of all-cause mortality were compared by regular log-rank testing with weights = 1. To determine survival in the dbGaP phs001807.v1.p1 cohort of patients with ALD85, the median RSPO3 expression was established as a threshold for high and low expression cohorts, for analysis of survival using Kaplan–Meier estimator curves of all-cause mortality and对数秩测试。此外，全基因组全基因组的肝转录组数据集没有HCC（Gene表达综合（GEO）：GSE49541（参考文献86）和GSE193066（参考文献87）（参考文献87））以及切除或消水的HCC（GSE192959（GSE192959）（Ref。87），酒精cressip cressoccied88（recransoccied cransoccoccoccoccoccoccoccoccoccoccoccoccoccoccoccoccoccied cransoccoccoccied cransocioccied cransoccoccoccoccoccocciccoccied of。分析了88））和与临床疾病表型和RSPO1，RSPO2，RSPO3，RSPO3和RSPO4基因的临床疾病表型的关联分析和严重与酒精相关的肝炎（GSE94397（参考文献88）），包括与已知的WNT途径靶标（CYP2E1和CYP1A2）相关联（包括CYP2E1 A2），并符合cyp1a2的转录，并与之相关联，并与之相关。在CLDS（预后肝脏签名（PLS））中，以及严重酒精相关的乙型肝炎的总生存率88。对于这些队列中的分析，根据每个队列中排名四分的临界值来定义RSPO基因的高表达。 预后转录组特征的高风险图案的存在由最近的模板预测算法90确定。使用Wilcoxon Rank-SUM测试，对数秩检验和/或Kaplan-Meier方法，根据每个队列中临床注释的可用性，使用Wilcoxon Rank-SUM检验，对数秩检验和/或Kaplan-Meier方法评估了高基因表达和高风险特征与临床表型和结果的关联。 　　我们使用肝转录组数据进行了代谢途径分析，将绝对hsc的肝脏与其对照（GSE211370），RSPO3FL/FL/FL/FL和RSPO3ΔHSC小鼠肝脏（GSE256398）（GSE256398）的肝细胞（GSE256398）进行了比较（GSE211370），以及来自CTNNB1ΔHEP和CTNB1F/CTNB1F/CTNB1F/CTNB1F/CTNB1F/exnnb1F/以前91。简而言之，根据基因 - 蛋白质反应（GPR）规则，我们将具有统计学意义的DEG（FDR≤0.05）转换为酶促反应率的变化。作为途径，反应和GPR规则的数据库，我们使用了鼠标1（v.1.3.0）代谢模型，基因组规模代谢重建92。然后根据其涵盖的扰动反应的量对代谢途径进行评分和排名。我们还计算了每种途径的P值以评估其统计学意义。我们使用了基于超几何分布91的高几何测试。使用Benjamini -Hochberg程序对计算的P值进行了FDR校正。 　　根据制造商的指示，使用MXP Quant 500 XL Kit（Biocrates Life Sciences）分析了Roswell Park综合癌症中心，代谢组学和药代动力学共享资源的SNAP冷冻小鼠肝样品。简而言之，使用Omni珠破裂24（OMNI）上的优化设置，以1 mg组织与3μL组织与3μl溶剂（25％乙醇和75％0.01 M磷酸盐缓冲液）的比率匀浆。离心后，在两个96孔板的适当孔中添加了10μl每个上清液，质量控制样品，空白，零样品或校准标准（已经包含内标），并在柔和的氮气中干燥。在一块板上，将样品用异硫氰酸苯基苯甲酸苯甲酸酯和生物胺衍生化，然后再次干燥。用甲醇中的5 mM乙酸铵对两个板上的样品洗脱。使用Shimadzu HPLC系统与SCIEX 5500质量光谱仪连接，将样品提取物用水进行HPLC -MS/MS分析（1：1）或运行溶剂（Biocrates Life Sciences）进行流动注入分析（FIA）–MS/MS（50：1）稀释。使用WebIDQ软件（Biocrates Life Sciences）和Limma进行差异代谢物分析来处理数据。 　　对于Desi MS成像，将新鲜冷冻的小鼠肝组织块嵌入5％明胶中，并在-80°C下储存。然后将组织块以8 µm（Leica，CM3050s）的厚度冷冻散热，并将安装在显微镜载玻片上，并存储在-80°C下，直到分析。将显微镜载玻片在真空干燥器中干燥8分钟。DESI MSI数据采集是在突触的G2-XS QTOF质谱仪上进行的，该质谱仪以阳性离子灵敏度模式为100-1,000的质量范围为正离子灵敏度模式。使用以下DESI参数：毛细管电压和采样锥电压分别为0.5 kV和50 V，DESI喷雾器角度为78°C，源温度为150°C，雾化气体（N2）压力为0.9 bar和40 µm的空间分辨率。所用的溶剂是甲醇：水95：5（v/v），甲酸和0.01％甲酸和40 pg µl -1亮氨酸enkephalin，流速为1.5 µl min -1。在HDI成像软件（Waters，v.1.6）和SCIL（Bruker，版本2024a）中处理和可视化数据。使用Leucine Enkephalin（[M+H]+，M/Z 556.2771）进行峰采摘和锁紧校正。通过针对Lipidmaps数据库93的精确质量搜索，也从先前通过脂质组学分析使用UPLC进行uPLC进行ION Mobility TOF MSE（HDMSE）数据依赖数据依赖的ackisition94进行脂质注释进行了脂质注释。IHC与谷氨酰胺合成酶共定位用于确定图像中的分区。在相应的脂质特征的曲线下使用面积的离子强度分布，并在SCILS软件中产生了归一化为TIC的M/Z间隔的平均强度。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量。研究人员对体内治疗和验尸后分析（例如（1）通过IHC进行定量以及（2）通过qPCR测定基因表达的人盲。由于没有单独的组或样品注释，研究人员没有对SNRNA-SEQ分析研究盲目。对于免疫印迹，在加载凝胶以以逻辑方式显示结果时，研究人员并未蒙蔽。使用GraphPad Prism（V.9.0）或R（V.4.0.2）确定统计显着性。在使用D'Agostino和Pearson综合态性测试和 /或Shapiro – Wilk的正态测试评估数据的正态分布后，计算了P值，并在图传说中描述了所有统计测试。使用Kaplan-Meier方法表示生存曲线，并使用对数秩统计数据进行比较。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。