阿司匹林通过限制抑制T细胞免疫的血小板TXA2来防止转移

　　所有动物实验均根据英国内政部的指南进行，并获得剑桥大学动物福利和道德审查委员会的批准。窝窝对照或年龄和性别匹配的小鼠用于实验中。除非另有说明，否则所有老鼠均载在剑桥大学生物医学服务Gurdon设施或Babraham Institute生物支持部门。从查尔斯河获得了野生型C57BL/6只小鼠。PTPRCA（CD45.1）Congenic，OT-1 TCRTG，RAG2 - / - 和MMTV-PYMT（B6.FVB-TG（MMTV-PYVT）634mul/lellj）小鼠是从杰克逊实验室获得的。先前已经描述了ARHGEF1-KO（ARHGEF1TM1A）小鼠。如前所述，TBXAS1-KO（TBXAS1TM1SWL）和TBXA2R-KO（TBXA2RTM1COF）小鼠，如前所述44,49。林。通过将ARHGEF1FL/FL小鼠与flpo-deleter小鼠交叉杂交ARHGEF1TM1A小鼠产生，然后与表达CRE的菌株（NCR1TM1.1（ICRE）（ICRE）VIV），VIV（lyz2tm1（lyz2tm1（lyz2tm1（lyz2tm1 fii）ifo））（lyz2tm1（lyz2tm1（lyz2tm1）ifo（cd4cre），分别产生有条件的敲除小鼠，分别为17,18,19。小鼠是通过Transnetyx基因分型的。PF4CRE PTGS1FL/FL小鼠先前已描述为42，并安置在“ G. d'Annunzio” Chieti-Pescara大学的动物设施中，并在2010年9月22日（EEC）指令下进行了2010年9月22日（EEC）指令（2010/63/EU）和国家伦理委员会（EEC）和国家伦理委员会（EEC）委员会（EEC）委员会（EEC）委员会（EEC）指令（EEC）委员会（EEC）委员会（EEC）委员会（EEC）委员会（EEC）委员会（EEC）委员会（EEC）委员会的（63/63/63/63/63/63/63/63/63/63/63）。 　　小鼠转移性黑色素瘤细胞系B16-F10（购自Kerafast）和B78Chova-Mcherry（由M. F. Krummel提供）51在补充10％FBS和抗生素的DMEM（Thermo Fisher Scientific）中传递。对于肺转移模型：在150 µL Dulbecco的PBS（DPB）中向5×105 B16-F10细胞静脉注射小鼠或B78Chova-Mcherry细胞，并在第14和17天之间解剖了肺部，以进行转移和后续分析。在补充10％FBS和抗生素的DMEM中，将LL/2鼠Lewis肺癌细胞转移。将小鼠在150μlDPB中注射1×106 LL/2细胞，并在第17天解剖肺。将肺固定在4％福尔马林中，然后嵌入石蜡中。从肺中心取切片，并用H＆E染色。使用Pannoramic Digital Slide扫描仪（3DHISTECH）拍摄幻灯片图像，并使用Quath软件进行分析。计算肿瘤负担为每个样品的总组织面积的百分比。对于肝转移模型：用异氟烷麻醉小鼠，并在左侧进行小切口以暴露脾脏。将3.5×105 B16-F10细胞悬浮在50μLDPB中的细胞被注入脾脏。伤口用缝合线和皮肤钉钉封闭。将小鼠安乐死，并在第11天解剖肝脏进行转移和随后的分析。阿司匹林（Aspégic，Sanofi Aventis和Sigma）以600 mg l -1的饮用水重悬。将TXA2模拟U46619（Cayman）稀释在DMSO中，并在50μgkg -1的饮用水中递送。所有的饮用水含有1％的蔗糖，每周被替换3-4次。对于血小板耗竭，从静脉注射肿瘤细胞前1天，每2天，每2天，在0.25 mg kg -1腹膜内给予小鼠。为了抑制研究，COX-1抑制剂SC-560（SelleckChem和ABCAM），COX-2抑制剂Celecoxib（SelleckChem），P2Y12抑制剂Ticagrelor（SelleckChem） 在静脉注射肿瘤细胞前5天以30 mg -kg -1进行媒介物对照，并在整个研究过程中继续进行。 　　每周一次对乳腺肿瘤触诊小鼠。在检测到第一个可触及的乳腺肿瘤后，每周三次进行数字卡钳进行长度和宽度测量来评估乳腺肿瘤。当总乳腺肿瘤面积超过2.25 cm2时，将小鼠安乐死并收集肺并固定在4％福尔马林中，然后再嵌入石蜡。从肺中心取切片，并用H＆E染色。使用Pannoramic Digital Slide扫描仪（3DHISTECH）拍摄幻灯片图像，并使用Quath软件进行分析。计算肿瘤负担为每个样品的总组织面积的百分比。 　　将MC38小鼠结直肠癌细胞转移到补充10％FBS和抗生素的DMEM中。将小鼠皮下注入100 µL PBS中的2.5×105细胞的侧面。从注射后的第7天开始，每周3次进行数字卡钳进行长度和宽度测量来评估肿瘤生长。 　　为了评估CD8+ T细胞对细菌感染的反应的实验，在每个实验之前，将细菌在BHI培养基中生长至OD600的0.1。小鼠用5×106菌落形成单元的亚致死剂量减弱（ΔActa）单核细胞增生液，表达OVA，静脉内给药52。感染后在连续时间点通过尾静脉收集血液样本。检测到CD8+ T细胞反应，并通过流式细胞仪分析其表型。 　　对于骨髓重建实验，在静脉注射来自8-至12周大的小鼠的单细胞骨髓制剂的静脉注射骨髓细胞之前，从137CS源中给予C57BL/6小鼠的1,000 Gy总体γ辐射。照射后将小鼠施用新霉素，并重建后两周以限制感染风险，并在重建后两到三个月时用于流式细胞仪和癌症转移实验。 　　通过通过40 µM细胞滤网（BD生物科学）的机械解离来制备淋巴组织中的单细胞悬浮液。在含有20 µg ML-1 DNase I（Roche）和1 mg ML-1胶原酶（Sigma Aldrich）的培养基中切碎肺，并在37°C下与搅拌40分钟一起孵育，然后通过40 µM细胞过滤器分离。使用冰冷的ACK裂解缓冲液（Gibco）裂解红细胞5分钟。在完全RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）中，使用PMA，Ionymycin，Brefeldin A和Monensin进行流式细胞仪分析之前，刺激需要细胞因子细胞因子细胞因子的细胞。根据制造商的说明，可以通过首先用僵尸紫外线固定的生存能力染料（Biolegend）或Efluor 780可固定的PBS中的可活力染料（EBISOSCIENCE）单独染色来区分可行的细胞。然后在FACS缓冲液中将细胞与冰上的特定表面抗体一起孵育40分钟，在存在2.4G2单克隆抗体以阻断FcγR结合的情况下。根据制造商的协议，使用EBISOSCIENT ANNEXIN V凋亡检测集（Thermo Fisher Scientific）对细胞表面磷脂酰丝氨酸进行标记。对于细胞内染色，Ebioscience FOXP3/转录因子染色缓冲套件（Thermo Fisher Scientific）或BD Cytofix/cytoperm固定/通透性试剂盒根据制造商的说明使用，然后根据荧光体染色的抗体构造抗体的细胞内染色，持续40分钟。使用各自软件使用Cytek Aurora（Cytek），BD LSR Fortessa（BD Biosciences）或Beckman Cytoflex（Beckman Coulter）细胞仪获取样品使用FlowJo V10.10.0软件（Treestar LLC）分析数据。 　　用于流式细胞仪的抗体如下：抗CD103--------------（2E 7，生物学，121418，1/20000），抗CD127-BV650（A7R34，生物学，.1/20000），抗CD39-AF647（抗CD39-AF647） （RM4-5，生物学，100536，1/200），抗CD4-BV650（RM4-5，生物学，100546，1/400），抗CD44444410。 17-0441-83，1/400），抗CD45.2-EF506（104，Invitrogen，69-0454-82，1/100），抗CD45.2-FITC（104，Biology，Biology，109805，1/200），Anti-CD61-PE（Anti-CD61-PE（2C9.G3，Invitr）抗CD69-PE-DAZZLE（H1.2F3，生物学，104536，1/20000），抗CD8α-BUV395（53-6.7，BD Horizo​​n，563786，1/20000），抗CD8α-BUV805（53-6.7，BD，BD，BD，6128,200） （53-6.7，Biologend，100752，1/200），抗CD8α-FITC，（53-6.7，Invitrogen，11-0081-86，1/200），抗CD90.1-FITC（OX-7 557266，1/100），抗foxp3-apc（FJK-16S，Ebioscience，17-5773-82，1/200），抗DIFNγ-BUV737（XMG1.2，BD，BD，BD，612769，612769，1/400）抗油-2-PE（JES6-5H4，生物学，503808，1/20000），抗KI67-PERCP-EF710（Sola15，Invitrogen，46-5698-80，1/200）抗KLRG1-BV605（2F1/KLRG1，生物学，138419，1/20000），抗LY108-APC（330-AAJ，生物学，134610，1/200）抗PD-1-APCEF780（J43，Invitrogen，47-9985-82，1/20000），抗PD-1-PE-CY7（RMP1-30，RMP1-30，BiologyEnd，109110，1/20000），1/2000，1/200）， 抗Perk T202/Y204-AF488，（197G2，细胞信号，13214，1/100），Anti-Perk T202/Y204-AF647（197G2，Cell Signaling，13148，1/100），1/100），抗PS6 S235/6-PE（D57.2.22.2e，1/6-PE，1/6-PE，1/6-PE），1/5316，5316，5316，5316，5316，5316，5316，5316，5316，5316，5316，5316，，5316，5316，5316，5316，5316，，5316。 Anti-St2-PERCP-EF710 (RMST2-2, Ebioscience, 46-9335-82, 1/200), Anti-TCF-1-RHE488 (C63D9, Cell Signalling, 6444s, 1/200), Anti-TCrβ-BV570, (H57-597, Biology, 109231, 1/200),抗-TCRβ-FITC（H57-597，生物学，109206，1/20000），抗TCRβ-PERCP-CY5.5（H57-597，生物学，109228，1/20000），抗PE-DAZZLE（1G9 12-9501-82，1/100），抗TIM3-BV421（RMT3-23，生物学，119723，1/100），Anti-TIM3-BV785（RMT3-23，BiologyEnd，BiologyEnd，119725，1/100），100），100），100抗TNF-BV650（MP6-XT22，生物学，506333，1/20000），抗TOX-PE（Rea473，Miltenyi，130-120-716，1/20000）和Ter119-FITC（Ter119，TER119，Invitrogen，Invitrogen，MA5-17822，1/1/200） 　　如前所述处理数据53,54。简而言之，首先在Flowjo版本10.10.0中进口流式细胞仪标准（FCS）3.0文件，以通过手动控件消除死细胞，然后选择CD45+白细胞，并经过Biexponential转换，然后通过使用固定的脚本来实现biexponential转换，然后通过使用现场的定制脚本进行计算分析（k值设置）。在这里，我们修改了Linux-Community和Core.py脚本，以将种子修复到“ 123456”（以Python版本3.7.3运行）。然后将数据以逗号分隔值（CSV）文件转换，并使用PANDAS软件包合并为单个文件。在FlowJo中进一步导入了作为新的CSV文件（每个集群）导出的数据，并分析以定义每种蛋白质及其中位荧光强度阳性的细胞百分比。最终使用GPLOTS R软件包将数据归纳。UMAP是使用UMAP Python软件包进行的。 　　根据制造商的协议，使用Magnisort小鼠CD8+ T细胞富集试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对单细胞悬浮液的CD8+ T细胞进行了预核。使用流式细胞术细胞表面抗体对细胞分选需要的标记，稀释为1/100，而细胞悬浮液则用套件的富集抗体鸡尾酒标记。再次过滤细胞，并重悬于RPMI 1640中，其中包含DAPI进行活/死歧视。使用BD融合或ARIA仪器（BD Biosciences）进行细胞分选。将细胞分类为补充了25％木炭分裂FBS（Gibco）的RPMI 1640溶液，然后准备进行实验，如下所述。 　　通过FACS分离出野生型和ARHGEF1-KO小鼠的脾脏和淋巴结的FACS，并用固定的超叶纯化的抗小鼠CD3ε（Biole-ole-leagengend）和超叶纯化的抗Mouse CD28（37.51; Biole rhr Rhr rhr rhr rhr-2）（5）（培养基）（5）培养物（37.51; Biep）rhr-2;4-5天。在某些情况下，根据制造商的说明，在刺激前将细胞用2.5μMCTV增殖染料（Thermo Fisher）标记。 　　如上所述纯化的CD8+ T细胞由脾脏和野生型和ARHGEF1-KO小鼠的FACS和淋巴结纯化。纯化的纯化的幼体CD8+ T细胞（0.8×105）用2.5μMCTV标记的纯化的抗CD3ε和可溶性抗CD28（每个5 µg mL-1; Biolegend; Biolegend; Biolegend）在含有10％Charcoal-Stripped FBS中的脂质培养基中激活5 ng gpcr and gpin and gpα（5 ng ML-2）配体如下：CXCL12（1μgml -1; R＆D），凝血酶（10个单位Ml -1; Sigma Aldrich），PAR1肽（10μM; ABCAM），PAR2肽（10μm; ABCAM），S1p（5μm; acros; acros lip lip lip lip lips lips lips limsi a aviid limsi;18：1溶解虫（1μM； Avanti极性脂质），LPA（1μM； Avanti Polar脂质），9-Hode（1μm; Cayman; Cayman），组胺二氢氯化物（5 mm; Sigma Aldrich），Prostaglandin E2（prostaglandin e2（0.5μm; Cayman）和u46619（calio）;在细胞培养的结尾，收集细胞，并通过流式细胞仪测量细胞增殖和激活。对于抑制研究，将细胞用TP抑制剂SQ 29548（Cayman）以10μM的浓度处理，从刺激前1小时开始，一直持续到细胞培养的结束。 　　在RHIL-2存在2天的情况下，用野生型和ARHGEF1-KO OT-1 TCRTG小鼠的CD8+ T细胞在体外用10 nm OVA257–264肽刺激，然后用RHIL-2进行3天的扩张。在TCR交联之前，将细胞在含有0.1％无脂肪酸BSA（Sigma aldrich）的RPMI 1640中饥饿过夜。然后将细胞与可溶性抗CD3ε抗体（Thermo Fisher Scientific）在4°C下孵育20分钟。洗涤后，在含有5μMU46619或DMSO对照的无脂质培养基中，使用山羊抗Armenian仓鼠IgG（H+L）（H+L）（H+L）（H+L）（H+L）（Jackson Immunoresearch）交联的CD3分子交联5分钟。对于蛋白质印迹，在交联后，将细胞立即在Pierce Ripa缓冲液中裂解，并具有完整的迷你蛋白酶和phostop磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche）。然后将细胞在2x Laemmli缓冲液（Bio-Rad）中用2-羟基乙醇变性，并在凝胶加载前在98°C下煮沸10分钟。使用TGX试剂（Bio-Rad Laboratories）和方案进行PVDF膜上的蛋白质印迹。转移后，用5％BSA封闭印迹，然后与针对PAKT-SER 473（193H12，细胞信号传导），PAN-AKT（9272，细胞信号传导），PS6-SER 235/236（D57.2.2e，d57.2.2e，细胞信号传导），S6（5G10，Cell Signbles Signbles），PS6（5G10），PS6-SER，PS6-SER（9272），pAN-AKT（9272，Cell-signal Signaling），PS6-SER，PS6-SER，217/217/信号传导），MEK1/2（9122，细胞信号传导），PERK1/2-THR202/Tyr204（D13.14.4E，D13.14.4E，细胞信号传导），ERK1/2（3A7，细胞信号传导），ARHGEF1（D25D2，D25D2，细胞信号传导），β-actin（AC74，Sigma aldrich）和GATRICH）和GATRICH（AC74，sigma aldrich）（1ESET）辣根过氧化物酶偶联的二抗（Bio-Rad）。使用化学发光（Thermo Fisher）开发了辣根过氧化物酶偶联的二抗印迹，并使用摄影膜在暗室中捕获了凝胶图像。为了抑制研究，将细胞与以下抑制剂进行预处理1小时：AKT抑制剂VIII（1μM，Calbiochem），TP抑制剂SQ 29548（10μM，Cayman），Cayman）， 岩石抑制剂Y-27632（30μM，Tocris）和GSK269962A（10μM，Apexbio）或PTEN抑制剂BPV（PIC）（PIC）（2.5μm，Sigma Aldrich）在TCR交联之前。 　　如上所述，在整个过程中使用无脂质培养基的单细胞悬浮液和指示基因型小鼠的淋巴结和肺部和肺。将两到三百万个细胞与特定的表面抗体和可溶性抗CD3ε抗体（Thermo Fisher Scientific）在4°C下孵育30分钟。洗涤后，使用山羊抗Artimenian仓鼠IgG（H+L）（H+L）（Jackson Immunoresearch）在含有5μMU46619或媒介物对照5分钟的无脂质培养基中交联CD3分子与抗CD3ε抗体进行交联。交联后，将细胞立即用冰冷的2％甲醛在4°C固定20分钟。固定后，将细胞用冰冷的90％甲醇在4°C下透化20分钟。使用抗腐烂T202/Y204 AF488-或AF647偶联的抗体（197G2）和抗PS6 S235/6-PE或-AF647（D57.2.2E）抗体抗体，使用抗腐烂T202/Y204 AF488-或AF647偶联抗体（D57.2.2E）抗体来测量S6和ERK的磷酸化。 　　使用RhoA下拉激活测定生物化学试剂盒（细胞骨架）测量RhoA的活性。过夜血清饥饿后，用5μMU46619在37°C刺激5μMU46619刺激10×106野生型和ARHGEF1-KO OT-1 TCRTG CD8+ T细胞5分钟。立即将细胞在4°C下用磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒在裂解缓冲液中旋转，洗涤并裂解。将五十微克的Rhotekin-RBD珠（细胞骨架）添加到裂解液中，并在4°C下旋转1小时。将样品向下旋转，洗涤3次，用2×laemmli缓冲液与2-甲醇乙醇变性，并在98°C下在凝胶加载之前煮沸10分钟。针对RhoA（ABCAM）的主要抗体用于蛋白质印迹。 　　铂-E生态包装细胞（细胞Biolabs）在一天前的浓度为6×106个细胞的浓度为6×106个细胞之前，将其镀二个细胞。使用10μg逆转录病毒质粒DNA转染包装细胞，使用Transit293（Sigma Aldrich）（Sigma Aldrich）在Optimem（Thermo Fisher Scientific）中（Thermo Fisher Scientific）中的8 hh intim Intribe Medive中的Meverem In Medive中，使用Transit293（Sigma Aldrich），以及6μgPCL-ECO质粒DNA以及6μgPCL-ECO质粒DNA。转染后8小时更换培养基，并将细胞再孵育48小时。逆转录病毒上清液用于用10 nm OVA257–264肽刺激后24小时刺激后表达Cas9 cas9 cas9 tcrtg CD8+ T细胞。简而言之，收集CD8+ T细胞，悬浮在病毒上清液中，并在24-phell板中以2,000g在2,000g的2,000g下在24孔板中旋转2 h，在8μgml-1的聚甲烯（Sigma Aldrich）存在下，加速度缓慢和减速。在急性重新刺激和磷酸流分析之前，将细胞在含有RHIL-2的培养基中培养3-4天。 　　对于CRISPR – CAS9诱变，使用Crispick Tool（Broad Institute）设计了三对RHOA的SGRNA对，并将其亚克隆为优化的逆转录病毒MSCV-SGRNA-PURO-THY1.1载体，并逆转录病毒被逆转到表达CAS9表达Cas9-cas9-CD8+ T细胞，如上所述。幼稚T细胞中TBXA2R的缺失如前所述55。In brief, three different sgRNAs targeting Tbxa2r: 5′-CCAGAGAAGCTCATGACAGG-3′, 5′-UUAGGAGCCAUGUGGCCCAA-3′ and 5′-CGAGGUGCCAUUGGGCCACA-3′ or their negative control: scrambled sgRNA#1 (Synthego) were incubated with Alt-R S.p.HiFi Cas9 Nuclease V3 Cas9（集成的DNA技术）使用LONZA 4D-核对象系统（DS137）将电穿孔成幼稚的MAC分类的CD8+ T细胞，以形成SGRNA – CAS9核糖核蛋白复合物。通过板结合的抗CD3ε和可溶性抗CD28（每个2 µg ml-1; Biolegend）和RHIL-2（5 ng mL-1）在培养中培养3天，然后在培养培养物中静止过夜3天，其中包含5μMU46619或车辆控制的脂质培养基中。 　　将肺组织立即浸入Rnalater稳定溶液（Thermo Fisher Scientific）中，以在-80°C下存储。通过使用rneasy Plus Mini Kit（Qiagen），根据制造商的说明，使用Qiagen TissuelySer II均质器在1 mL RLT加裂解缓冲液（Qiagen）中均质匀浆。通过上述幼稚的CD8+ T细胞（CD62L+ CD44-CD8+）通过富含FACS的总CD8+ T细胞纯化，如上所述，并被板结合的抗CD3和溶解性抗CD28（每个5 µg ml-1）激活，无脂肪含量为5天，含有5天的fbs，在5天内含有5天的fbs，在5天中均具有5天的含量。和U46619（1μm）。然后将细胞沉淀并重悬于40 µL rnalater稳定溶液中，以在-80°C下储存。使用QIASHREDDER试剂盒（Qiagen）进行细胞样品的处理，然后根据制造商的协议，使用RNeasy Plus Mini Plus Kit（Qiagen）提取RNA。通过Novogene使用mRNA文库制备试剂盒（Poly A富集）制备RNA库，并由Novogene对Novaseq PE150进行测序。然后，使用FASTQC对FASTQ文件进行质量控制，然后使用Star Workflow对齐NCBIM37 Mus Musculus基因组注释。使用DESEQ256对所有表达基因（> 20个检测到的读数）进行差异基因表达分析，并进一步分析了差异表达的基因，并使用R。用R包装热图生成了表达热图。 　　在嵌入石蜡之前，将肺固定在4％的福尔马林中。从肺的中心取切片，并使用常规的组织学方法用H＆E染色。幻灯片是基因型盲，并为病理特征独立评分。 　　使用代谢笼收集了接受静脉注射B16-F10细胞的小鼠的尿液样品。前列腺素E2，前列腺素D2，Prostaglandin I2和TXA2的全身性生物合成通过量化其主要尿液酶代谢物的评估：PGEM，PGDM，PGDM，PGIM和TXM分别使用液体色谱量 - 直接质量质量图表，如前所述。Urine samples (0.2 ml aliquots) were added with internal standards: tetranor PGEM-d6 (final concentration of 10 ng ml−1, Cayman), tetranor PGDM-d6 (final concentration of 10 ng ml−1, Cayman), 2,3-dinor-6-keto-PGF1α-d9 (sodium salt) (final concentration of 10 ng ml−1, Cayman) and2,3-Dinor-TXB2-D9（最终浓度为10 ng ml-1，开曼犬）。将样品在室温下孵育15分钟，然后再添加甲酸（5μl）。孵育15分钟后，加入甲氧基胺HCl（1 g mL -1，0.1 ml）（Sigma aldrich）。在室温下孵育30分钟后，将尿液样品用水调节至pH 3的水稀释至1 ml，并用数字层型33U 33U聚合物反向相位（30 mg ml-1，eynomenex）提取，并用1 ml乙腈和1 mL的水58.58,59。用1 ml的水（5％乙腈）洗涤，将带有样品的载荷的数量层X 33U聚合物逆转相位柱，然后在乙酸乙酯中用1 ml的5％乙腈洗脱。将洗脱株蒸发，并将干燥的残留物重悬于100μl流动相（在水中10％乙腈）中，并将30μl注入到一个可爱的UPLC I-Class/Xevo TQS Micro-IVD系统（WATERS）中，配备了电源电源电源源（Esi Z-Spray），以前的情况下，该条件是不足的。 　　如前所述60分离出血小板。简而言之，使用含有100μl酸柠檬酸葡萄糖（Sigma aldrich）的注射器通过心脏穿刺收集血液。立即将样品与改良的泰罗德缓冲液混合，以防止血小板过早激活。将血液以300克离心5分钟，并收集富含血小板的血浆（PRP）层。随后将PRP以200克离心8分钟以增加纯度。在最终浓度为1μgml -1的最终浓度以限制过早的血小板激活，并立即将样品在1,000克时立即离心11分钟。将细胞重悬于改良的泰罗德缓冲液中。使用以下抗体通过流式细胞仪确定血小板计数和纯度：亚美尼亚仓鼠抗小鼠/大鼠CD61-PE抗体（2C9.G2，Biolegend），大鼠抗小鼠TER119-FITC抗体（TER119，EBISOSCIENCE）和抗MOUSE CD45.2-percp-cy5.5 antibody（ly5.5 antiby5.2）。血小板纯度大于90％。 　　将标记为2.5μMCTV标记的血小板和幼稚的FACS分类的CD8+ T细胞与24孔Transwell板的30：1共培养（0.4μm孔径，康宁）。如上所述，在RHIL-2（5 ng mL-1）的情况下，在Transwell底部的幼稚CD8+ T细胞通过板结合的抗CD3ε和可溶性抗CD28（每个5 µg ml-1）激活。5天后，根据制造商的说明，仔细地收集上清液，并使用势头箱B2 ELISA试剂盒（Cayman）测量TXB2水平。如前所述，收集T细胞并处理流式细胞仪。 　　如上所述，从野生型和ARHGEF1-KO OT-1 TCRTG小鼠的CD8+ T细胞在体外产生了5天。将5×105的血清饥饿细胞播种在13毫米盖玻片（VWR）上，用10μgml-1 Ultra-Leaf™纯化的抗小鼠CD3ε预先涂覆，在24孔板中。用10μMU-46619或DMSO对照刺激细胞在37°C下进行10分钟。固定后用15毫米甘氨酸和PBS洗涤。用FC阻断抗FCR抗体（克隆2.4G2，BD）阻断盖玻片。然后将细胞与兔抗小鼠PTEN（138G6，细胞信号传导）抗体一起孵育，然后是驴抗兔IgG-alexa Fluor 647（A31573，Thermo-Fischer）抗体和珊瑚岩594-甲状腺素（蛋白质）。使用带有DAPI的延长钻石抗固定式安装板将盖玻片安装在VWR超抛光显微镜幻灯片（Appleton Woods MS527）上（Thermo-Fischer p36962）。为了进行抑制实验，将细胞用10μMTP抑制剂SQ 29548，岩石抑制剂30μMY-27632和10μMGSK269962A或DMSO进行预处理1小时。 　　使用Leica Application Suite X（LAS X）软件（V1.4.6.28433）在Leica TCS SP8倒置共聚焦显微镜上捕获图像，并在三个通道中具有63倍油化物镜，在三个通道中，F-肌动蛋白（黄色）和PTEN（黄色）和DAPI核核核副型（蓝色）（蓝色）（蓝色）（蓝色）。获得Z堆栈以捕获每个区域中的整个细胞。每种治疗条件的复制都成像三到五个不同的位置。分析的图像是从跨批量图像堆栈中心选择的四个连续Z链的最大强度投影。使用Cell-Profiler 461构建了图像分析管道。简而言之，使用F-肌动蛋白图像产生细胞掩模，使用从DAPI图像中段的核膜造成的种子A核。这些细胞面膜可以通过使用F-肌动蛋白图像进一步将膜和细胞质区域分为膜。PTEN在膜上与细胞内的平均荧光强度的比例测量值用于报告其重新定位到膜。 　　在图4a（14,025个基因；补充表3）中，在RNA-Seq实验中检测到的每个表达的基因都经过单样本基因集富集分析（SSGSEA）分析62。SSGSEA用于测试每个基因集的相对富集，其中包含每个重复样品的总表达基因转录谱中的MSIGDB C7免疫信号基因集。SSGSEA首先为每个样品计算该样品和其余样品之间每个表达基因的差分表达。然后，与其他样品相比，每个样品中表达基因的差异表达水平都被排名。然后计算每个样品中每个C7基因集中基因的非随机分布（富集），从而为每个样品集获得每个基因集的样品富集评分。这是通过分析每个C7基因中基因在每个样品的差分表达序列列表中的分布来实现的。每个差异富集基因集的样品富集评分（错误发现率（FDR）< 0.2, |FC| > 1.5) is represented in the heat map provided and the identity of each gene set in the heat map is given in Supplementary Table 4. Each gene within each of the gene sets included in the analysis can be looked up using the following link: https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/human/genesets.jsp?collection=C7. 　　从ATCC获得了经过验证的B16-F10黑色素瘤细胞。从细胞Biolabs获得平台细胞。经过验证的MC38结直肠腺癌细胞是从耶拉法斯特获得的。供应商将所有线路都验证为不含支原体，并在冷冻保存之前以低通道频率扩展。 　　使用未配对的两尾学生T测试，Mann-Whitney U检验，普通的单向ANOVA或双向ANOVA测试对数据进行分析。大多数实验不需要盲目，因为使用了客观定量测定，例如流式细胞仪。对于肿瘤实验，同窝对照或不同基因型的年龄和性别匹配的小鼠是随机的，并且在注射前再对基因型视而不见，然后再计算转移结节或评估组织学图像以进行客观评估。使用功率计算，初步实验选择实验样本量，或基于类似实验中可变性的先前经验。随后的分析中排除了在处理过程中发生技术故障的样本。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。