依赖上下文的歌曲测序的灵活电路机制

　　参见补充表1和2。 　　在黑色丙烯酸外壳内的两个定制圆形室（根据参考文献13修改）进行了行为实验。通过每个外壳内部的LED垫（3.5''×6'''白色，中期技术）提供环境光。对于每个房间，视频记录为60 fps（flir Blackfly S单声道1.3 MP USB3半Python 1300，BFS-U3-13Y3M-C，具有TechSpec 25 mm C系列使用Mot Recording System和api（loopbio gmbH），在22 in in Inffrm in Infrm Ill in Infrm py py py py py py py pyssspec 25 mm c系列vis-nir固定焦距镜头），并运行2.7（高级照明高性能明亮的场环灯，6.0''o.d。，Wash Down，IR LED，IC2，飞行导线）和红外带通滤波器，可阻止用于光遗传学的红灯（Thorlabs高档带通滤波器；直径25 mm，中央波长，中心波长= 850 Nm，全宽度，最大宽度为最大= 10 nm）。从16个粒子速度麦克风（Knowles NR-23158-000）铺平地板的16个粒子速度麦克风（Knowles nr-23158-000）记录了声音。将麦克风用IR吸收染料手绘，以限制录制视频中的反射伪像（Epolin Specter 160）。使用模拟热传感器（Adafruit TMP36）在每个腔室内监测温度。 　　每100毫升食物以1毫升ATR溶液（100 mM为95％乙醇），将果蝇保存3-5天，或补充1毫升ATR溶液（100 mM）的常规视网膜（ATR）。ATR喂养的苍蝇在黑暗中饲养。Cschrimson使用627 nm LED（Luxeon Star）以1-205μwmm-2的速度激活Cschrimson。 　　对于所有行为实验，在Eclosion后3-5天使用了处女男性和处女。在孵化器灯打开的120分钟内开始实验。男性和女性分别是单身和群体。使用定制的吸气器在实验前将苍蝇轻轻加入行为室中。首先将女性放置在配对实验中。将室盖用sigmacote（SL2，Sigma-Aldrich）涂上，以防止苍蝇在天花板上行走，并在烟雾罩下保持至少50分钟，然后才能进行实验。视频是手动评分的。除非统计偏差需要排除整个记录，否则将超出交配的数据排除在分析之外。 　　如前所述，进行了3​​0分钟的免费求爱记录3。 　　使用1/8 Hz的固定刺激频率用于光遗传神经激活。刺激辐照度可以采用四个不同的值（0、1、25和205μWmm -2），跨越三个数量级，刺激效率周期可能需要五个不同的值（1/64、1/32、1/16、1/16、1/8和2/8），以及在16个不同的范围内（在16个截然不同的范围内）组合了irrifiance offerection（均在16个截然不同的范围内）。伪随机订单每个120 s。 　　为了进行后续的离线分析，使用修改后的正弦检测参数如前所述，如前所述11,13进行了分割，以说明此处使用的设置中的不同声学（params.pval = 1×10-7）。对于给定的录制，歌曲分割算法的输出包括有关每次回合和每个正弦火车的开始和结束的信息，以及每个检测到的脉冲的中心，以及不包括歌曲的噪声片段。为了降低由于正弦歌曲的振幅低（柔和的歌曲模式）而污染以人为分裂的污染统计数据的风险，我们排除了所有包含幅度低于选择的信号到噪声（SNR）阈值的正弦歌曲的回合。具体而言，我们使用歌曲分割软件自动检测并返回并返回的噪声部分（因此不包含歌曲）估算了噪声幅度，首先通过将16维（16个麦克风）噪声段降低到一维矢量中，通过将最大的巨型噪声的噪声值存储在每个时间点，然后定义99噪声的噪声频率的噪声值，然后将99噪声的噪声定义为99的绝对效果，以实现99的绝对效果。向量。正弦振幅的计算相似，使给定的正弦回合的SNR是正弦振幅和噪声幅度的比率。我们从进一步的分析中排除了包含1.3以下SNR的正弦歌曲的回合。此外，由于间歇性的噪音，歌曲细分器偶尔会分开单个正弦火车。未经纠正，例如，这可以将“ PSP”回合分为一个“ PS”和一个“ SP”回合非常接近。这使我们可以使用简单的时间阈值合并，如果比赛间间隔低于0.5 s。该细分软件可在https://github.com/murthylab/murthylab_flysongsegmentsementer上免费获得。 　　雄性和女性姿势（头部，胸部以及左翼和右翼尖端的位置）自动估算和跟踪，并使用Sleap17（Sleap.ai）手动校对所有视频。 　　对于开放环光学神经激活的实验，在给定刺激块试验期间的任何时间点唱歌的脉搏或正弦歌曲的概率被计算为包含脉搏或正弦歌曲的试验的一部分。为了分析将歌曲概率分为遥远和近乎上下文，试验中的平均MFDIST被阈值分配给了两种情况之一。然后仅使用分配给该上下文的那些试验来计算每个上下文的歌曲概率。 　　歌曲分割提供了有关每次回合的开始和结束的信息，以及在回合中的所有脉搏和正弦事件，允许每个回合分配一个标签，描述了包含的脉搏和正弦列车的顺序（对于仅包含脉搏歌曲的“ P”，“ Spspspspsp”，“ Spspspsps”，“ SPSPSPSPS”，“ spspspspp”，以一首歌，随后是脉搏之间的几次交替，随后是脉搏和SINE和SINE之间的几次交替）。对于统计数据，我们通过用一个或多个歌曲的替换为“ PS ...”或“ SP ...”来减少不同的回合类型的数量，并将其称为“复杂P”或“复杂S”。“急性”和“持久”回合被定义为在刺激期间或刺激后偏移后的回合。反弹的歌曲被定义为刺激后偏移后开始的歌曲，在刺激期间开始的回合（例如，如果PS击球中的初始脉冲火车在刺激期间开始，但是以下正弦序列在刺激偏移后开始，则被认为是弹力的正弦）。 　　使用卷积神经网络构建TAP探测器模型。卷积神经网络由两个二维卷积层组成，然后是两个完全连接的层。这两个卷积层分别具有32个输出和64个输出通道，内核大小为5，步幅为1。每个卷积层的输出通过整流的线性单位非线性和一个二维最大池层压层，其核心大小为两个，两杆为两个。第一个完全连接的层具有53,824个输入和32个输出功能，然后具有整流的线性单位非线性，第二个完全连接的层具有32个输入和2个输出功能，对应于TAP或NON-TAP的得分。使用ADAMW算法对100个时期的ADAMW算法进行训练，其批量大小为16，学习率为0.0001。该模型是使用Pytorch Library 54构建和训练的。 　　为了训练卷积神经网络，使用自定义的图形用户界面手动标记为雄性以男性为中心的视频框架（尺寸为128×128），将其标记为TAP或非TAP事件。十个视频用于创建TAP数据集，共有12,606个手动注释。在这些带注释的框架中，有70％用于训练，并将30％的人保留用于模型验证。对固定数据进行了接收器操作特征分析，以确定模型召回（真实阳性率）与辐射（假阳性速率）之间的关系，这是TAP检测阈值的函数。 　　Tap率被量化为歌曲回合中的TAP数量，除以回合的持续时间（要与回合前的时间进行比较，我们使用了回合之前的同等大小窗口中的TAP数量，除以Bout持续时间）。 　　我们使用p（Tap）≥0.9的TAP概率的阈值与P1神经元的已知钙荧光一起响应于雌性腹部的单个腹部（TAP-TAP-trignd触发27的平均水平），以获得P1A Neural Active of P1A Neural Active of Free to Maress os Mansent os Mansement os Mansers os Mansement，我们将TAP检测网络的二进制输出（TAP = 1/no TAP = 0）与P1神经元的已知钙荧光进行了阈值。我们将估计的钙荧光信号与GCAMP6S钙响应的核（2.6 s）55进行了反应，以获得P1A速率的估计值，我们将其用于进一步分析。 　　对于给定的记录，首先使用摄像头触发信号进行同步，首先将视频分辨率的二进制TAP检测器输出提升到音频分辨率。对于带有领先的脉冲歌曲（简单p或复杂的PS ...）的每首歌曲回合，对回合（nding，nding，计数）进行的检测到的龙头数量进行计数，并将其除以回合的持续时间B，以在回合，rduring = nduring = nduring/b期间产生TAP速率。作为控件，计算出回合之前的TAP速率是在回合之前的同等大小的时间窗口B中发生的TAP数量，rbefore = nbefore/b。在简单和复杂的比赛中平均每只动物（使用平均值）平均水龙头率，并用于进一步分析。 　　为了估算出在回合选择上不同感觉特征的相对预测能力（在此，复杂与简单p），我们使用了稀疏的广义线性建模框架，然后在惩罚非预测的历史权重之前，如前所述3,56。简而言之，十个感官特征（男性和女性前向速度（MFV和FFV），横向速度（MLS和FLS），旋转速度（MRS和FRS），男性（女性）胸腔的角度相对于雌性（雄性）体轴（Fmangle和Mfangle），男性和女性胸腔（MFDISTANE）的距离（MFDISN），以及Instaine frof the的距离（MFDIST），以及Instaine frof the的速度（MFDISTANE）。（P1率）首先使用移动平均过滤器平滑，该滤镜宽度为20个视频帧（0.33 s）。然后，从历史的5秒内从平滑的特征中提取21个均匀分布的样品，直到每次回合的第一个脉冲序列的结束，并使用领先的脉冲歌曲（对于简单的脉搏回合，这对应于回合的末尾）。提取的功能是每个功能的Z得分，以说明不同的特征维度和尺度。通用线性模型（GLM）的输入是转换的特征和相应的二进制矢量，指示给定的特征历史记录是否对应于简单或复杂的脉冲回合，并且对每个功能的输出估计了输出的滤波器（提供有关该功能窗口中动态中最可预测性的动态的信息，是对零件类型的最终预测性的）和相对偏差的降低。为了估计合适性，我们每次使用70％的输入数据（随机采样而无需替换）重复GLM拟合51次。对于每个功能，跨拟合的平均值和与跨拟合平均值的平均绝对偏差进行了计算并用于显示。 　　我们使用定制的两光子激光扫描显微镜57,58在PIP10光遗传激活后成像了VNC中DSX+细胞的活性。如前所述59，将处女雄性苍蝇（5-8天）安装并解剖，差异很小。简而言之，我们将腹部和胸部侧面朝上，朝向解剖室的底面，揭示了中央大脑的腹侧和VNC的腹侧。从头部中，我们取出了长鼻，周围的角质层，空气袋，气管以及其他脂肪或软组织。从VNC中，我们将胸部组织腹侧移至VNC（例如，腿和表皮），暴露了VNC的第一部分和第二部分。在整个实验过程中，将灌注盐水连续地传递到物镜和解剖腔之间的弯月板上。我们成像DSX+ TN1细胞（一次半球），位于VNC第二段的腹侧。具体而言，尽管我们使用了表达所有DSX+神经元中钙指示剂GCAMP6s的果蝇，但我们仅对prothoracic和间胸神经瘤进行成像，以及VNC的辅助间胸神经胶体。这些区域一起容纳了神经元的PR1-3，PR4，MS1-3和TN1簇，它们的somas具有独特且可识别的位置。我们从这些区域手动分割了这些区域，这些区域基于它们的解剖位置，被明确识别为TN1神经元。TN1可以根据躯体在前后轴中的位置与DPR1（属于PR1-3簇）区分开。同样，TN1可以根据其相对于辅助间胸神经胶质以及较小的somas的侧面位置和腹侧位置而与其相邻簇（PR4和MS1-3）区分开。我们的手动细分基于这些标准，而不是基于神经反应。我们以1 Hz的速度记录了大约70×70×20 µm3的3–4个子卷 （0.3×0.3×2 µm3至0.4×0.4×2 µm3体素尺寸），覆盖TN1簇（〜70 µm）的全腹侧范围。使用scanimage 2017收集体积数据，并使用Flycaiman58（https://github.com/murthylab/flycaiman）通过MATLAB 2018B进行处理。简而言之，使用Normcorre算法在XYZ轴上校正了GCAMP6S信号的体积时间序列，并在XYZ轴上进行了运动，并在时间上重新采样以校正相同体积的平面和相对于胶原式刺激插入（线性插入）的开始的相同体积和时间戳的不同平面的不同切片时序。使用NormCorre沿Z轴缝合沿Z轴连续记录的亚参数。通过使用约束的非阴性矩阵分解算法对DSX+ TN1 SOMAS进行分割，以获得每个SOMA的时间痕迹和空间足迹，如CAIMAN58,62所实现（所有TN1 SOMAS的初始数字和XYZ位置均已手动预先定义）。对于PIP10激活，我们使用了一种光遗传学方案，该方案在孤立的，自由地行为的男性中激活PIP10时，将长长的刺激驱动强脉冲和较弱的弹力正弦（图2C，E）。具体而言，我们使用了2 s的刺激（在13 µW mm -2辐照度下），而2秒钟则重复了四次，以最大程度地提高诱发的GCAMP响应的大小。成像始于刺激发作前10秒钟，在刺激发作之前，在该刺激开始，在该刺激发作中测量了基线活性，并在刺激后持续10 s。 　　使用带Python3的Brian2软件包63进行网络模拟。单个神经元被定义为具有与实验预测相匹配的已知尖峰特性（例如回弹或补品尖峰）的Izhikevich Model64的变体。简而言之，通过三个普通微分方程对神经元膜电位V进行了建模： 　　随着膜回收变量U，时间尺度A和对恢复变量膜电位的亚阈值波动的灵敏度B，输入电流I. GE和GI是兴奋性和抑制电导性，并且τsyn是突触时间常数。每当膜电位达到30 mV时，这被认为是动作电位，并且通过膜变量通过 　　完整的歌曲电路模型包括四个Izhikevich神经元，称为P（Pulse），S（Sine），PC2和INH。选择参数a，b，c和d以启用脉冲和正弦节点的抑制后反弹动力学，以及PC2和INH节点的滋补尖峰（补充表3）。抑制性连接在脉冲和正弦之间相互定义，从INH到脉冲和正弦以及从PC2到INH。从PC2到脉冲定义了单个兴奋连接。PC2共同为脉冲节点提供了兴奋性输入和对INH节点的功能抑制，模仿了从PC2通过PIC10到VNC的直接脉冲途径，并分别从PC2通过P1A（激活了短的MFDIST和强度输入到PC2；图5A）。对于突触前神经元中的每个尖峰，突触电导GE，我被我们递增了。我们是在遗传算法优化过程中适合的自由参数。剩余的游离参数是进入INH节点中的补体输入电流的量（Itonic，调节对核心脉冲– Sine电路的补品抑制量，模仿男性的默认值，无刺激，状态），即控制感官输入电流进入PC2中的增益。在给定的野生型求爱的给定记录期间，感官输入电流是MFDIST，并通过非线性（NL）转换。 　　为了促进在短/较大距离下对PC2的强/弱输入电流。使用Euler集成进行网络的数值模拟，并记录每个节点的尖峰时间以进行进一步分析。具体而言，模型的“歌曲序列”是根据脉冲和正弦节点的活性来定义的，因此，一个节点的连贯的尖峰列车与另一个节点的下一个尖峰至少相距300毫秒，这是一个简单的回合，而在300毫秒内的交替活动被认为是一个复杂的回合。这种简化的假设使我们能够使用遗传算法优化将模型拟合到实验性歌曲统计（见下文）。我们没有明确对控制回合持续时间的机制进行建模，我们希望需要其他功能，例如脉搏中的复发激发和正弦节点来维持脉搏或正弦火车。所有模型参数均在补充表4中指定。 　　The distribution of model bout types in response to a given naturalistic stimulus was directly comparable with the actual distribution of male song bouts corresponding to the sensory stimulus, which we exploited to fit the four free parameters of the model (a scalar gain factor for the input to the pC2 node, the strength of a constant input current to the inh node, and one global weight each for all excitatory and inhibitory connections) to the experimental data.具体而言，我们使用遗传算法优化（python中的遗传算法套件，https://pypi.org/project/project/project/geneticalgorithm/）来最小化root-mean-squared差异，以实验性和模拟分布之间（使用六张曲式类型，“ P’，p’，psss”，“ psp”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”，“”算法比使用四个类别最终用于分析的算法，这会导致模型略微拟合），以及通过目标函数root-square-squared差异+0.1ΔNBOUT（有关优化参数和优化参数），实验和模拟回合数量（ΔNBOUT）之间的绝对差异（ΔNBOUT）。选择了两个目标的相对缩放，以优先考虑回合数量的回合分布。所有遗传算法参数均在补充表4中指定。四百秒的歌曲数据，从所有20个野生型录音中随机选择，至少10％的歌曲回合远非女性（MFDIST> 4 mm），用作遗传算法的输入。 　　为了测试电路模型的不同计算特征的相关性，我们比较了完整模型的遗传算法拟合性能（此处使用200-S歌曲片段，从所有野生型录音中随机选择），以拟合模型版本的性能，并用单个计算特征“敲除”或更换。Specifically, although in the full model both the p and the s nodes were rebound excitable (by choosing the appropriate values for parameters a, b, c and d (see Supplementary Table 3), rebound excitability was knocked out in the pulse (no rebound pulse), sine (no rebound sine) or both nodes (no rebound) by adjusting parameters a, b, c and d (to turn these nodes from ‘rebound spiking’ into“滋补”；请参见补充表3），通过将INH节点的抑制性突触拆除到脉冲和正弦节点上，以比较默认模型的实验性数据。形成一个兴奋性节点（“ exc”），我们删除了dis抑制模型中INH节点的滋补输入。 　　在实验室的中心，测量了室内盖子的辐照液（使用胸部PM100D功率计）的辐照度水平，并在实验室的中心进行了室内盖。两个相同的实验设置用于行为实验，并校准了辐照度水平，以跨设置具有均匀的电压转换。 　　在两光子钙成像过程中报道的光遗传学刺激的辐照度在大约的制剂水平（物镜之后）测量了（也使用胸部PM100D功率计）。 　　在MATLAB 2019a或Python 3.7中进行了统计分析。除非另有说明，否则使用平等中位数的双面Wilcoxon级别测试（Mann-Whitney U检验）进行统计组比较。误差条表示平均值±平均值与平均值的绝对偏差，除非另有说明。样本量不是预先确定的，但与以前出版物中报道的样本量相似13,34。在数据收集和分析过程中，实验者并未对实验的条件视而不见。基于基因型定义了实验组，并且数据采集相对于不同的基因型。所有复制尝试都是成功的。对于框图，中央标记表示框的中间，底部和顶部的中间边缘分别表示25个百分位数和第75个百分位数。晶须延伸到远离盒子边缘的四分位数范围的1.5倍。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。